電泳允許通過 SDS-PAGE 分離的蛋白質通過電泳轉移從凝膠轉移到膜上。在我們的蛋白質印跡指南的第 3 部分中，Jackson公司詳細介紹了電印跡的過程以及對其成功至關重要的一些注意事項。

在通過 SDS-PAGE 進行電泳之后，通過電泳轉移將分離的蛋白質從凝膠上電印跡到膜上。聚丙丨烯酰胺凝膠和轉移膜在被夾在負電J（陰J）和正電J（陽J）之間之前直接接觸。

陰J放置在凝膠后面，陽J放置在膜后面。當施加電壓時，蛋白質從凝膠遷移到膜，在那里它們被固定。結果是膜上凝膠圖案的鏡像。然后在免疫檢測之前封閉印跡（電印跡膜）。

圖：使用電印跡槽將蛋白質從 SDS-PAGE 凝膠轉移到膜上。

Jackson公司：膜的類型

膜可由硝酸纖維素或聚偏二氟乙烯 (PVDF) 制成。

硝酸纖維素

硝酸纖維素膜是非疏水性的，被認為通過非共價力與蛋白質相互作用——靜電和疏水特性。

硝酸纖維素很容易水合，并為大多數檢測方法提供低背景信號。

然而，硝酸纖維素膜在干燥后會變脆，如果要進行替代蛋白質的剝離和重新檢測，則難以處理。

聚偏氟乙烯

PVDF 膜具有化學惰性，比硝酸纖維素膜更堅固，便于剝離和重新探測替代蛋白質。PVDF 是疏水的，通過疏水和偶J相互作用與蛋白質相互作用。因此，與硝酸纖維素膜相比，它們可以形成更強的相互作用，使它們能夠結合更多的蛋白質（~150 µg cm2）。

然而，更大的膜蛋白親和力可能會增加膜與一抗和二抗相互作用的可能性，從而增加背景信號的可能性。

PVDF 可能會自發熒光，如果要進行熒光檢測以避免背景信號，則必須使用低熒光 PVDF 膜。由于 PVDF 的疏水性，膜在印跡之前需要在甲醇中“潤濕"。這使緩沖液能夠滲透基質并使蛋白質與膜結合。

Jackson公司：Western Blotting 轉移步驟中需要考慮的因素

毛孔大小

如果感興趣的蛋白質特別小或特別大，則可能需要考慮膜孔徑。

較大的孔允許更大范圍的蛋白質尺寸，但會增加小蛋白質在轉移過程中穿過膜的風險。

而較小的孔提供更大的結合表面，增加結合能力并減少小蛋白質通過膜的機會。結合孔徑大小，應考慮蛋白質濃度。

雖然膜和蛋白質之間的高結合親和力確保了足夠的蛋白質結合以進行準確的分析/檢測，但在高蛋白質濃度下，這可能導致蛋白質-蛋白質自結合而不是蛋白質-膜相互作用，并在洗滌步驟中導致蛋白質損失。

洗滌步驟

SDS 可以抑制蛋白質轉移到膜上，因此聚丙丨烯酰胺凝膠可以用去離子水洗滌，然后放入轉移緩沖液中 15-30 分鐘以與緩沖液平衡。

然而，在此過程中，小蛋白可能會從凝膠中遷移出來，因此在執行洗滌步驟之前應仔細考慮。懷疑樣品含有具有許多疏水性氨基酸或高分子量的蛋白質，可以使用具有低濃度 SDS（0.02 至 0.1%）的轉移緩沖液來防止其沉淀。

緩沖液 pH

轉移緩沖液保持高于蛋白質等電點的 pH 值，確保它們保持負電荷并向陽J遷移。

常見的轉移緩沖液使用 Towbin 系統（192 mM 甘氨酸、25 mM Tris、20% 甲醇）。這種低離子強度緩沖液的 pH 值為 8.3，高于大多數蛋白質的等電點。

除了鹽的類型和濃度，添加酸性或堿性溶液來調節 pH 值會影響離子含量，從而影響緩沖液的電導率。

高離子水平會導致運行溫度升高，這可能會導致轉移效率低下并增加不良偽影的可能性。

添加甲醇

可以將甲醇 (MeOH) 添加到轉移緩沖液中以提高蛋白質膜轉移效率。添加 MeOH 可能會導致凝膠收縮，增加凝膠密度并延緩遷移，特別是對于高分子量蛋白質。

為了防止這種情況，凝膠在增加體積的甲醇中平衡，直到達到所需的濃度。

建議使用分析級 MeOH，因為較低級別的甲醇可能含有金屬雜質，會損壞儀器，因此應避免使用。

應在使用前添加 MeOH，以防止緩沖液變質或溶劑蒸發。

電壓

組裝好凝膠膜夾層后，將盒子放入緩沖液罐中，并施加電壓以驅動蛋白質從凝膠轉移到膜上。

施加電壓的電壓強度和周期會影響蛋白質轉移的效率，必須針對每個系統進行優化。

短時間的低電壓會導致不*轉移，而長時間的高電壓會加熱系統，導致不正確的轉移。

高電壓也可能導致小蛋白質通過膜而不結合。這可以通過在個膜后面放置一個額外的膜來捕獲這些多肽來觀察。

理想情況下，應優化條件以確保所分析的所有大小的蛋白質都能令人滿意地轉移。

Jackson公司專注于親和純化的二抗和純化免疫球蛋白研究，服務領域覆蓋各大學科研所和醫院里的動物研究以及生物醫學研究機構的科學家。艾美捷科技是Jackson公司的中國代理商，為科研工作者提供優質的產品與服務。