簡介
單細胞 RNA 測序 (scRNA-seq) 是一種用于對復雜細胞 和組織樣本中的基因表達進行無偏差表征的技術。盡管 scRNA-seq chedi改變了現代生物學，但在技術上仍然具 有挑戰性，并且通常成本高昂。目前市場上的解決方案能夠在擁有數萬個細胞的初始池時對一小部分細胞進行有效分析。然而，處理稀有細胞群的 scRNA-seq 文庫制備 的簡化方案仍然缺失。 在這里，我們開發了一種新型孔板檢測法，用于性價比 高且高度 敏 感的 scRNA-seq。該工作流 程 支 持 來自稀 有細胞群的稀有樣本文庫制備。在此新工作流程中 ( 圖 1 )，我 們 使 用 了 DispenCell 和專用檢測吸頭 ( SEED Biosciences，瑞士 )，與專用和優化的單細胞文庫制備系統 ( MERCURIUS 高靈敏度 BRB-seq 試劑盒，Alithea Genomics，瑞士 )。
單細胞分配
首先，在測序文庫制備之前，我們測試了 DispenCell 在專用裂解緩沖液中分配單細胞的能力。淋巴細胞系從冷凍的小瓶中解凍，傳代兩次，然后在單細胞懸浮液中收 獲。使 用 10 μm 細胞過濾器 ( Miltenyi Biotec，德 國 ) 過濾細胞，計數并在無 RNAse 的甲基纖維素分配溶液 (DispenMe、SEED Biosciences) 中 稀 釋 至 最 終 濃 度 為 2×104 cells/mL。 然 后，使 用 DispenCell 傳感吸頭從細胞懸浮液中裝載 200 個 細 胞。設 置 DispenCell 將單細 胞分配 到 384 孔 板，孔板預裝 4.2 μL 裂解緩沖液 ( HS BRB seq 試劑盒， Alithea Genomics )。前 96 個孔 分 配 大 約 7 分鐘。然 后，停止分配，因為我們有足夠的樣品進行下游分析。
單細胞質量控制
分配后，我們立即使用 SEED Biosciences 開發的軟件 DispenSoft 進行單細胞質量控制后處理。孔板的每個孔 用顏色編碼的矩陣表示 ( 圖 2.a)。 當孔中含有單個細胞時，軟件將其標記為綠色，而紅色 孔中則含有零個或多個細胞，應丟棄。為了區分碎片和細 胞，通過對基于大小的直方圖進行門控來設置閾值 ( 圖 2.b )。只有高于閾值的峰才算作細胞。
在這里，我們獲得了 77 個單細胞孔 ( 80% 單細胞分離 率 )。使用 DispenSoft，原始阻抗數據也可用于記錄過程。可手動檢查每個阻抗曲線。單尖峰是單細胞的特征 ( 圖 2.c ) 而多個細胞產生多個峰。這表明 DispenCell 能 夠以簡單、快速和wanquan可追溯的過程在裂解緩沖液中分 配單細胞。