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熒光顯微鏡的應(yīng)用要點須知
閱讀：1193發(fā)布時間：2021-12-4
1)熒光顯微鏡預(yù)檢查和調(diào)節(jié)
(1)每次進行熒光觀測前，必須例行檢查熒光裝置的燈絲對中、光路對焦、孔徑光闌、視場光闌設(shè)置等狀況。
(2)所需要的熒光激發(fā)/發(fā)射濾光片組件是否已裝在轉(zhuǎn)換器中，物鏡配置是否得當(dāng)，除去物鏡前透鏡的油漬和灰塵。
(3)如同時進行透射光相差觀察，要檢查聚光鏡對中心及相差環(huán)與物鏡相反的共軛情況。
(4)檢查樣品載體(載玻片、蓋玻片和其他器皿)有否掛有液體、灰塵，厚度是否在物鏡標(biāo)定的工作距離范圍內(nèi)。切片樣品不能太厚，約≤10μm為宜。
(5)因照明光源含有紫外線，在載物臺前上方放一塊棕色遮光板，以防紫外線損傷視網(wǎng)膜。
(6)電壓不穩(wěn)會降低高壓汞燈的使用壽命，光源電源最好加配穩(wěn)壓器。
(7)為延長汞燈壽命，在開啟后15min方可關(guān)閉；汞燈熒光電源一旦關(guān)閉，再次啟動至少需等待10min，以使水銀蒸汽冷卻復(fù)至原態(tài)，否則會影響燈的壽命。
2)熒光鏡像觀察
(1)在開啟熒光燈源后約5～10min激發(fā)光強度趨于穩(wěn)定，裝載樣品進行觀察；為防止在調(diào)焦和尋找物像過程中過度激發(fā)光照會造成樣品熒光淬滅，最好先通過縮小熒光照明器的孔徑光闌或加ND濾光片將激發(fā)光調(diào)節(jié)到適度強度，有規(guī)律地移動樣品臺，待確定鏡像后，在調(diào)節(jié)到最佳熒光狀態(tài)用于拍攝記錄。
(2)鏡像質(zhì)量不佳的調(diào)整。排除樣品制備因素外，可進行的必要調(diào)節(jié)措施是：
①排除成像光路中的遮光或限光器件，如DIC附件、ND濾光片等。
②重新調(diào)節(jié)熒光照明器的收光器對焦和孔徑光闌大小。
③細心調(diào)節(jié)物鏡覆蓋差校正環(huán)。
④復(fù)查熒光激發(fā)/發(fā)射組件是否與所標(biāo)記的熒光色素對應(yīng)。
(3)在不影響分辨率的前提下，于照相取景框和CCD靶面范圍之外，可盡量回縮熒光光路視場光闌和物鏡(100X物鏡)的數(shù)值孔徑光闌調(diào)節(jié)環(huán)，以避免雜散光的影響、提高景深，并可減小激發(fā)面積防止附加樣品淬滅。
(4)暫時不觀察時，應(yīng)阻斷激發(fā)光路。
(5)油鏡觀察時，須用“無熒光油”，尤其是在U、V激發(fā)時，因常規(guī)鏡檢用的香柏油帶有青色熒光。
3)熒光顯微鏡的熒光照相和數(shù)字CCD相機圖像采集
(1)熒光照相
①盡管肉眼觀察熒光鏡像亮度與普通明場相差無幾，而實際上曝光時間要增加數(shù)倍甚至幾十倍，應(yīng)使用快速感光膠片，如ISO200(24DIN)、ISO400(27DIN)。
②根據(jù)熒光物像在測光區(qū)的分布比例和鏡像的明暗程度設(shè)置曝光補償調(diào)節(jié)，原則上適當(dāng)增補償，以獲得背景黑暗熒光圖像明亮、鮮艷的照片效果。
③如果沒有照明標(biāo)線取景器，可先選擇較明亮的熒光區(qū)域進行對焦調(diào)整。
④對點狀熒光物像或撲捉某點為主的拍攝，可選擇適當(dāng)?shù)狞c測光模式。
⑤對在同一幅需要同樣條件拍攝的分散點狀熒光物像，可試用點測光配合自動鎖定方式拍攝。
⑥曝光過程應(yīng)避免任何振動，有條件可配置防震臺。
(2)數(shù)字CCD相機圖像采集
①光學(xué)接口的中間倍率要與CCD的芯片尺寸合理匹配。
②采用合適的熒光拍攝模式，摸索減背景(Background Subtraction)處理條件，根據(jù)鏡像情況設(shè)置Binning、Gain、Gamma等參數(shù)。
③因CCD芯片靈敏度較高，如果熒光鏡像過于明亮，為獲取對比度較好的采集圖像，可適當(dāng)縮小熒光照明器孔徑光闌或加ND濾光片，特別是在熒光輝光較強影響拍攝樣品細節(jié)的情況時。
實際工作中，為獲得較好的熒光圖像拍攝質(zhì)量需要對上述調(diào)節(jié)機制的綜合運用，反復(fù)摸索、優(yōu)化條件。
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