使用方法
1) 取出印記膜，加入合適的封閉液在溫室下孵育20-60分鐘，同時振蕩，以封閉膜上非特異性蛋白結合位點。
2) 將膜從封閉液中取出，與一抗工作液在溫室孵育1小時，同時振蕩；或在28℃孵育過夜，不振蕩。
3) 將足量的洗滌緩沖液加至膜上，保證緩沖液將膜*覆蓋。振蕩孵育≥5分鐘，更換洗滌緩沖液并重復該步驟4-6次。增加洗滌緩沖液體積，洗滌次數和洗滌時間有助于降低背景信號。
注：1）孵育前，膜在洗滌緩沖液中的短暫淋洗會提高洗滌效率；2）按前文建議的HRP標記二抗稀釋度非常重要的。
4) 將HRP標記的二抗工作液與膜在溫室孵育1小時，同時振蕩。
5) 重復步驟3，以除去未結合的HRP標記二抗。注：膜與HRP標記二抗孵育后必須進行*洗滌。
6) 將A溶液與B液等比例混合，制備成工作液。每cm2膜使用0.01～0.1ml工作液，工作液可以在溫室下穩定8小時。
7) 將印記膜在工作液中孵育5分鐘。從工作液中取出印記膜，并置于一個塑料片或清潔的塑料紙（膜）中，用一張吸水紙吸除多余的液體，并從印記和塑料紙之間小心地壓出氣泡。
8) 將包在塑料紙（膜）中的印記膜置于膠片暗盒中，蛋白質面朝上，除適用于膠片曝光的燈（如紅色安全燈）之外，關閉所有的燈。
注;1）膠片必須在曝光期間保持干燥；2）確保將多余的底物從膜和塑料紙上*去除；3）在整個膠片處理期間，使用手套。
9) 將X光膠片置于膜的上面。建議次曝光60秒。之后可調整曝光時間以達到結果。化學發光反應在底物孵育后的前5-30分鐘期間是強烈的。這一反應可以持續幾個小時，但強度會隨時間下降，如有底物孵育后較長時間后曝光，曝光時間可能需要延長以獲得較強信號。如果使用磷光存儲成像設備（如Bio-Rad的分子成像儀系統）或CCD照相機可能需要較長的曝光時間。
注：膠片與膜之間的任何移動可能在膠片上造成人為的非特異信號。
10）使用合適的顯影劑和定影劑對膠片進行顯影。如果信號強，則縮短曝光時間或將印記膜進行剝離并降低抗體濃度重新檢測。
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