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上海嘉鵬
主營產品： 超微量分光光度計,核酸蛋白檢測儀,超微量紫外分光光度計,nano光度計,超微量核酸蛋白檢測儀 |
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2019-2-27 閱讀(2806)
1.原理
等電聚焦凝膠電泳是依據(jù)蛋白質分子的靜電荷或等電點進行分離的技術，等電聚焦中，蛋白質分子在含有載體兩性電解質形成的一個連續(xù)而穩(wěn)定的線性pH梯度中電泳。載體兩性電解質是脂肪族多氨基多羧酸，在電場中形成正極為酸性，負極為堿性的連續(xù)的pH梯度。蛋白質分子在偏離其等電點的pH條件下帶有電荷，因此可以在電場中移動；當?shù)鞍踪|遷移至其等電點位置時，其靜電荷數(shù)為零，在電場中不再移動，據(jù)此將蛋白質分離。
等電聚焦中，只有在凝膠兩端給以高電壓時，才能獲得較好的蛋白質條帶分辨率，這就需要非常有效的凝膠冷卻系統(tǒng)（否則會導致燒膠），即凝膠同期周圍液體之間的熱傳遞效率要高。由于平板膠熱傳遞能力高，并可方便的同時比較多種蛋白質樣品，所以平板膠用在等電聚焦上的居多。
由于等電聚焦對蛋白質的電荷差異非常敏感，若要好的重復性，制備蛋白樣品時一定要小心，要避免任何對蛋白質化學組成和結構的修飾。另外，蛋白質－脂類、蛋白質－蛋白質相互作用可引起電荷改變，進而導致等電點遷移或紋理現(xiàn)象。除非特殊需要研究蛋白質－蛋白質相互作用或者必須保持蛋白質的生物學功能，等電聚焦通常在含有尿素的變性凝膠系統(tǒng)中進行。使用非離子去垢劑也可以提高分辨率。
2.主要儀器、試劑
儀器：微型電泳系統(tǒng)、電源、注射器、固定和染色用容器
試劑：丙稀酰胺、雙－丙稀酰胺、載體兩性電解質、尿素、過硫酸胺、TEMED、TritonX－100、溴酚藍、磷酸、氫氧化鈉、考馬斯亮藍、甲醇、乙酸。
儲存液：1）30%（w/v）丙稀酰胺，1%（w/v）雙－丙稀酰胺；2）20%Triton X100；3）10%三***；4）1%三***；5）1%溴酚藍；6）考馬斯亮藍染色液；7）考馬斯亮藍脫色液；
3.載體兩性電解質的選擇
載體兩性電解質是一些具有相近等電點的分子量為600－900Da的多氨基多羥基兩性化合物的混合物，下面時配置不同pH范圍等電聚焦凝膠的載體兩性電解質的配方：
4.灌膠
以灌制8cm×7cm×0.75mm pH4-6變性等電聚焦凝膠的配方。其他pH范圍等電聚焦可以參考表格來配置。
水：5.4ml； 儲存液1）：2.0 ml； 載體兩性電解質溶液pH3.5-10 48μl； 載體兩性電解質溶液pH4-6 240μl； 超純尿素 6.0 g ；10％過硫酸胺25μl； TEMED：20μl
灌膠步驟：1）組裝灌膠器；2）將尿素、水、溶液1）和載體兩性電解質溶液混勻，避免劇烈搖動，輕微加熱尿素溶解更快（帶手套，丙稀酰胺有毒）；3）加入過硫酸胺和TEMED，輕輕混勻（開始聚合，操作要迅速）；4）將上述混勻溶液倒如灌膠器（盡量避免氣泡產生）；5）插入梳子，將梳子侵入膠內（不要產生氣泡）；6）聚合約1小時；7）聚合完成，小心拔去梳子；8）將凝膠同冷卻裝置連接后插入電泳池，蛋白樣品上樣前好用陽極電極液注入上槽中確定是否有滲漏。
注意：1）上樣前沖去上樣空底部未聚合的丙稀酰胺，否則電泳過程中會發(fā)生聚合；2）現(xiàn)在有商品化的等電聚焦凝膠，但只限于水平平板電泳系統(tǒng)（如Pharmmacia－LKB,Hoefer）.
樣品制備和上樣：
一般不同厚度的凝膠，不同的梳孔數(shù)目會有不同的上樣量，例如：0.75mm厚、15孔的凝膠每孔大上樣量大約15μl。
變性凝膠上樣緩沖液2×Buffer（適用于pH4-6）：1）尿素：2.4g；2）pH3.5-10載體兩性電解質：20μl；3）pH4-6載體兩性電解質：100μl；4）20%Triton X－100：500μl：5）50μl；雙蒸水：1.7ml；1％溴酚藍：200μl
5.電泳：
操作步驟：
1）將蛋白樣品于等體積的2×上樣緩沖液混合，10000×g離心5min以除去蛋白質沉淀；2）用微量注射器將蛋白質樣品加入到上樣空底部，注意不要溢出來。注意：對于考馬斯亮藍染色液來說，每個泳道10-30ug的蛋白混合粗提物（我們俗稱粗抗原）或者5-10ug單一蛋白組分是較合理的上樣濃度。
電泳液：
1）上槽中加入陰極電泳液（20mM氫氧化鈉：須由1M儲存液新鮮配置）；
2）下槽中加入陽極電泳液（10mM磷酸：須由1M儲存液新鮮配置）。
等電聚焦電泳條件：
1）接好電極；
2）恒壓150V電泳30min；
3）恒壓200V電泳2.5h，開始時候控制電流為10mA左右，在聚焦過程中電流有所下降，電泳內室溫度在電泳的過程中將升至40－50攝氏度。
6．電泳聚焦后處理
測定pH梯度：
1）將凝膠條切成0.5cm或1cm的小片；
2）將每小片凝膠在1ml 10mM KCl中 浸泡30min；
3）測讀此KCl溶液的pH值、
凝膠的固定：
1）將凝膠于10%三***中浸泡10min；
2）換成1%三***溶液繼續(xù)浸泡至少2h以上，以去除載體兩性電解質，浸泡過夜可以更好的降低考馬斯亮藍對載體兩性電解質的染色。
凝膠的染色：用考馬斯亮藍染色，然后脫色，制成干膠。
7.天然等電聚焦電泳的修正方案
如果要進行天然等電聚焦電泳，要做一些修改；
1） 膠過程中配的凝膠中不需要加尿素；
2）上樣緩沖液（2×）5ml：其中1.8ml水，200μl載體兩性電解質（同制膠成分），3ml甘油，上樣時候于等體積樣品混勻，10000×g離心5敏即可上樣；
3）室溫下電泳，接好電極，恒壓下先200V電泳1.5h，再400V電泳1.5h。
