維生素D是一種脂溶性維生素，其具有促進生長和骨骼鈣化，促進牙齒健全、用于治療佝僂病、骨軟化癥等功能作用，是一種大家廣為熟知的營養元素。《中國藥典》2020年版《0722維生素D測定法》，保留原先的第一、二、三法外，新增加了第四法——柱切換二維液相法。

本次，小編和您一起探討新加入的第四法。

 什么是柱切換二維液相法？

柱切換二維液相法是將不同選擇性分離柱組合，加強分離能力的聯用技術。柱切換液相色譜系統通常由第一維分離柱和第二維分離柱串聯組成，兩柱之間以切換閥作為接口，通過流動相流路的改變，將部分或全部第一維柱流出的組分，導入第二維柱進行二次分離，從而起到凈化目標化合物，提高系統分離能力的作用。如果只是將部分組分導入第二維柱分析，通常又稱為中心切割二維液相法，用LC+LC表示；如果是全部組分全部導入第二維柱，通常稱為全二維液相色譜法，用LC×LC表示。

 新增加的第四法，優點有哪些？

《中國藥典》2020年版四部《0722維生素D測定法》，采用高效液相色譜法測定維生素D制劑中所含維生素D含量，以及維生素AD制劑或魚肝油中所含維生素D及前維生素D（折算成維生素D）的總量。

•當待測藥品中無維生素A及其他雜質干擾可用第一法測定，否則應按第二法處理后測定；

•如果按第二法處理后，前維生素D峰仍受雜質干擾，僅有維生素D峰可以分離時，則應按第三法測定，或不經前處理按第四法測定。第二法和第三法的供試液制備需要采用“正相收集、反相洗脫”，第三法為了進一步去除前維生素D峰的雜質干擾，還增加了水浴加熱再凈化的過程，前處理較為麻煩，一個實驗常常需要2~3天時間來完成；

•第四法通過在線凈化的方式，省去了復雜的前處理步驟，讓儀器來代替復雜的人工操作！且相比較而言，第四法的儀器配置更為簡單，是藥品中維生素D檢測的不錯選擇！

 島津應對方案

該方案在島津中心切割二維液相系統上進行。系統配置包括一維二元高壓系統和二維四元低壓系統，兩個紫外檢測器，一個進樣單元和一個柱溫箱；柱溫箱中裝載兩根不同性能的色譜柱，并通過加載一個高壓流路切換閥實現一維和二維的實時切換。

圖1. 島津二維液相（中心切割）系統

 01 前處理：

按照《中國藥典》2020年版四部通則0722維生素D測定法第四法要求進行制備。

 02 分析條件：

第一維色譜柱：HILIC-10（2.1x150 mm，3 µm）

第二維色譜柱：RX-SIL（3.0x100 mm，1.8 µm）

第一維流動相：A相：正己烷；

B相：正己烷-正戊烷-異丙醇（98：1：1）；

按下表程序進行梯度洗脫

第二維流動相：正己烷-正戊醇-異丙醇（996：2：2），等度洗脫

流速：0.5 mL/min                

進樣體積：100 µL

柱溫：40℃                             

檢測波長：265 nm

收集管：聚醚醚酮（peek）管，內徑0.0762 cm（0.03英寸），20 m，容積約9 mL

 03 對照品溶液色譜圖：

取方法中的校正因子f2上機測試，得到對照品溶液色譜圖。其中第一維液相維生素D的理論塔板數超過2500，與前維生素D的分離度＞5；各峰的重復性為0.76%~1.46%（n=5），均滿足藥典的要求。

圖2. 對照品溶液第一維色譜圖（上）和第二維色譜圖（下）

 04 供試品溶液色譜圖：

取制備好的供試品溶液上機分析。在第一維色譜圖中，由于維生素A醇和油脂的干擾，前維生素D被大量雜質峰包裹，無法檢測；將該時間段的物質切入第二維色譜中繼續分析，前維生素D和維A醇、油脂等雜質在第二維色譜圖中得到了有效的分離。

圖3. 供試品溶液第一維色譜圖（上）和第二維色譜圖（下）

 05 參與驗標工作：

島津廣州分析中心參與了該方法的驗標工作；制標專家和島津工程師共同建立并驗證了方法，方法可靠、穩定，可有效地應對《中國藥典》0722通則第四法柱切換色譜法。