流式分析樣品的準備

流式一、

樣品的準備

試驗一：組織培養(yǎng)細胞的細胞準備

材料

AccutaseTM Enzyme Cell *培養(yǎng)基（eBioscience Cat.No. 00-4555）　　流式細胞儀染色液（eBioscience Cat.No. 00-4222）　　15或50ml尖底離心管

實驗過程

1． 對于懸浮培養(yǎng)的細胞，把細胞分裝到一個尖底離心管中，對細胞進行計數(shù)和活性分析，然后進入步驟3；

2． 對于貼壁培養(yǎng)的細胞，建議用AccutaseTM Enzyme Cell *培養(yǎng)基從培養(yǎng)皿上吹起并吹散細胞凝聚物，然后把細胞分裝到一個尖底離心管中，對細胞進行計數(shù)和活性分析，進入步驟3；

3． 離心細胞然后用流式細胞儀染色液重懸細胞使其終濃度為2×107個細胞/ml。

試驗二：淋巴組織的細胞準備

材料

60×15 mm 組織培養(yǎng)皿

3 ml注射器

細胞濾網(wǎng)（血液尼龍濾網(wǎng)）

流式細胞儀染色液（eBioscience Cat.No. 00-4222）

15或50ml尖底離心管

實驗過程

1． 采集組織（采集組織（脾，淋巴結，胸腺）放進一個細胞培養(yǎng)皿中，用3 ml注射器的活塞擠壓以制成單細胞懸液，此過程用10ml的染色緩沖液；

2． 加入10ml染色液收集細胞，使細胞懸液通過尼龍濾網(wǎng)以除去成團的細胞和細胞碎片，收集細胞懸液于尖底離心管中；

3． 4℃離心細胞懸液4-5分鐘（300-400g），棄掉上清液；

4． 重懸細胞沉淀，細胞計數(shù)和活性分析；

5． 按照步驟3離心細胞然后用合適體積的染色液重懸細胞，使細胞終濃度為2×107個細胞/ml。

試驗三：非淋巴組織的細胞制備

材料

剪刀或者手術刀片

PBS

60×15 mm 組織培養(yǎng)皿

3 ml注射器

細胞濾網(wǎng)（血液尼龍濾網(wǎng)）

流式細胞儀染色液（eBioscience Cat.No. 00-4222）

15或50ml尖底離心管

實驗過程

1． 采集組織，用剪刀或手術刀切成2-4mm的小塊；

2． 按照酶的使用說明書，加入適量用PBS稀釋的酶，孵育。酶的選擇可以參照以下：http://www.tissuedissociation。。ｃｏｍ；

3． 用移液管輕輕吹散細胞，并用濾網(wǎng)過濾除去成團的細胞和細胞碎片；

4． 4℃離心細胞懸液4-5分鐘（300-400g），棄掉上清液；

5． 用PBS重懸細胞沉淀以移除剩余的酶溶液；

6． 重復步驟4；

7． 重復步驟5和6；

8． 用流式染色液重懸細胞沉淀，細胞計數(shù)和活性分析；

9． 按照步驟4離心細胞然后用合適體積的染色液重懸細胞，使細胞終濃度為2×107個細胞/ml。

試驗四：

材料

PBS

FicollTM或其它的培養(yǎng)基

流式細胞儀染色液（eBioscience Cat.No. 00-4222）

15或50ml尖底離心管實驗過程

1． 在尖底離心管中用PBS按1:1的比例稀釋血樣；

2． 用FicollTM 等倍稀釋樣品；

3． 離心20分鐘；

4． 收集PBS和FicollTM交界處的PBMC；

5． 在試管中加入PBS；

6． 4℃離心細胞懸液4-5分鐘（300-400g），棄掉上清液；

7． 用流式染色液重懸細胞沉淀，細胞計數(shù)和活性分析；

8． 按照步驟6離心細胞然后用合適體積的染色液重懸細胞，使細胞終濃度為2×107個細胞/ml。

用淋巴組織細胞懸液在流式細胞儀上分析以前，去掉紅細胞。

試驗一：鼠脾細胞中紅細胞的裂解：

材料

1×PBS

eBioscience 紅細胞裂解液(Cat.No.00-4333)

50ml 尖底管

1． 采集小鼠的脾臟并且制成單細胞懸液；

2． 4℃ 離心沉淀細胞（300-400g），棄掉上清液；

3． 用5ml脾的紅細胞裂解液重懸細胞；

4． 室溫震蕩孵育4-5分鐘（也可在冰上進行）；

5． 加入20-30ml PBS 停止反應；

6． 4℃ 離心沉淀細胞（300-400g），然后用合適體積的緩沖液重懸細胞沉淀，繼續(xù)下一步試驗；

7． 細胞計數(shù)。

試驗二：小鼠血液的紅細胞裂解

材料

1×PBS

eBioscience 紅細胞裂解液(Cat.No.00-4333)

50ml 尖底管

1． 1ml小鼠血液中加入10ml 紅細胞裂解液；

2． 室溫震蕩孵育4-5分鐘（也可在冰上進行）；

3． 加入20-30ml PBS 停止反應；

4． 4℃ 離心沉淀細胞（300-400g），然后用合適體積的緩沖液重懸細胞沉淀，繼續(xù)下一步試驗；

5． 細胞計數(shù)。

試驗三：人外周血中紅細胞的裂解

材料

1×PBS

eBioscience 紅細胞裂解液(Cat.No.00-4333)

50ml 尖底管

1． 1ml人的血液中加入10ml 紅細胞裂解液；

2． 室溫孵育10分鐘（不要超過15分鐘）；

3． 加入20-30ml PBS 停止反應；

4． 4℃ 離心沉淀細胞（300-400g），

然后用合適體積的緩沖液重懸細胞沉淀，繼續(xù)下一步試驗；

5． 細胞計數(shù)。