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【新品上線】多重病原菌質(zhì)控品

2024-12-16 閱讀(457)

專家共識

 
 

多重病原菌檢測是一種先進的診斷技術(shù),它能夠同時檢測和識別多種病原體,包括細菌、病毒、真菌和寄生蟲等。這種檢測方法在感染性疾病的診斷中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用,特別是在病原體多樣且復(fù)雜的情況下,能夠快速準(zhǔn)確地確定病原體,從而制定有效的治療方案。

 

病原宏基因組高通量測序技術(shù)(mNGS)作為一種新型的基因水平檢測技術(shù),無需預(yù)設(shè)、無需培養(yǎng)、無偏好性,能夠全面檢測標(biāo)本中的所原體遺傳物質(zhì)(包括DNA和RNA),并進行高通量測序。基于生物信息學(xué)算法,該技術(shù)可以與病原數(shù)據(jù)庫進行比對分析,鑒定樣本中病原微生物的種類及功能信息,為臨床抗感染提供精準(zhǔn)的病原學(xué)證據(jù)。

 

為了規(guī)范病原宏基因組高通量測序技術(shù)在臨床本地化檢測中的應(yīng)用,中國藥師協(xié)會、中華醫(yī)學(xué)會細菌感染與耐藥防治分會、國家衛(wèi)生健康委臨床抗微生物藥物敏感性折點研究和標(biāo)準(zhǔn)制定專家委員會等機構(gòu),于2024年1月在《中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志》聯(lián)合發(fā)表了《病原宏基因組高通量測序臨床本地化檢測規(guī)范專家共識》。該共識在實驗室符合國家相關(guān)政策法規(guī)以及保證檢測方法性能可靠的前提下,對如何在本地開展mNGS檢測提出了具體指導(dǎo)意見。

 

 

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干實驗的性能確認(rèn)

 

當(dāng)生物信息學(xué)分析流程建立后,需對其進行性能確認(rèn),可以通過三類數(shù)據(jù)集進行:(1)臨床標(biāo)本測序數(shù)據(jù)集:注釋充分、特征明確的臨床標(biāo)本測序數(shù)據(jù)(FASTQ或其他格式);(2)計算機模擬測序數(shù)據(jù):利用序列模擬軟件模擬生成測序數(shù)據(jù)集,要求既要具有與真實測序數(shù)據(jù)質(zhì)量相同/相似的技術(shù)參數(shù)(文庫片段長度分布、測序模式、測序錯誤類型及頻率、測序質(zhì)量值、測序深度等),也要盡可能對臨床標(biāo)本的背景成分信息如宿主核酸、微生物和試劑背景核酸等進行模擬;(3)組合數(shù)據(jù)集:利用序列模擬軟件定量模擬一種或多種目標(biāo)病原體的測序數(shù)據(jù),然后將模擬序列添加到目標(biāo)病原體陰性標(biāo)本的真實測序數(shù)據(jù)中,形成接近臨床標(biāo)本的模擬數(shù)據(jù)集。利用上述數(shù)據(jù)開展性能確認(rèn),確定干實驗流程的主要性能指標(biāo),包括準(zhǔn)確率、精確率、召回率和 F1-Score(即精確度和召回率的調(diào)和平均值)等。如果在比對過程中出現(xiàn)寄生蟲的假陽性結(jié)果(寄生蟲為真核生物,與宿主序列相似度較高,且部分寄生蟲基因組數(shù)據(jù)中存在人源序列的污染),需要考慮設(shè)置更高的陽性匯報閾值或者對相應(yīng)寄生蟲的基因組數(shù)據(jù)進行清洗。常見的寄生蟲匯報閾值為與陰性對照相比RPM 達到 10 倍以上,基因組數(shù)據(jù)清洗常采用把目標(biāo)寄生蟲基因組單獨與人基因組比對并去除高度同源的序列。

 

全流程的性能確認(rèn)

 

確認(rèn) mNGS 濕實驗和干實驗全流程對病原體的檢測能力是否能夠達到臨床預(yù)期用途。在全流程性能確認(rèn)中至少應(yīng)包括革蘭陽性菌、革蘭陰性菌、分枝桿菌、絲狀真菌、酵母菌、DNA 病毒、RNA病毒、寄生蟲,同時應(yīng)關(guān)注胞內(nèi)菌和難破壁的病原微生物。

性能確認(rèn)參數(shù)可參考《分子診斷檢驗程序性能驗證指南》《臨床微生物培養(yǎng)、鑒定和藥敏檢測系統(tǒng)的性能驗證》《病原宏基因組高通量測序性能確認(rèn)方案》等,建議實驗室 mNGS 檢測系統(tǒng)應(yīng)對方法符合率、交叉反應(yīng)、精密度、準(zhǔn)確度、檢出限、抗干擾能力(如針對高人源標(biāo)本)、穩(wěn)定性等性能參數(shù)進行確認(rèn)。

 

樣品盤的制備

 

樣品盤要包含模擬參考品和已知病原檢測結(jié)果的真實臨床標(biāo)本。樣品盤的設(shè)置應(yīng)嚴(yán)格遵循臨床預(yù)期用途所涉及的標(biāo)本類型,所含微生物應(yīng)有代表性,盡可能覆蓋預(yù)期用途中的病原體。標(biāo)準(zhǔn)微生物菌株可以選用ATCC或CMCC菌株等。應(yīng)根據(jù)不同標(biāo)本類型來合理地設(shè)置模擬參考品中的人源細胞濃度(如支氣管肺泡灌洗液的人源細胞濃度中位數(shù)為 105cells/ml)。模擬參考品中應(yīng)至少包含革蘭陽性菌、革蘭陰性菌、絲狀真菌、酵母菌、分枝桿菌、DNA 病毒、RNA 病毒、寄生蟲共 8 類病原微生物。在制備模擬參考品前,針對所有待投入微生物進行檢出限(limit of detection, LoD)研究并確認(rèn)是否能滿足預(yù)期用途中對檢測性能的要求。

......

 

 

 

產(chǎn)品數(shù)據(jù)

科佰生物新推出了多重病原菌質(zhì)控品,選擇具有代表性的病原組成見下表。以上病原均可溯源,各病原基因組數(shù)據(jù)科佰可提供。

 

內(nèi)含4個革蘭氏陽性菌和4個革蘭氏陰性菌,2個真菌。

 

12.12 趙天嬌_Sheet1.png

 

鑒于細菌破壁提取難易程度對檢測結(jié)果的影響,我們分別使用了市面上不同廠家的試劑盒對如上質(zhì)控品做了提取,并使用相應(yīng)數(shù)字PCR探針檢測對應(yīng)的拷貝數(shù),如圖所示,不同的提取試劑檢測得到的結(jié)果會有較大的差異,與該試劑盒提取的偏好性相關(guān)。

 

同時,我們也對此產(chǎn)品進行了mNGS的檢測,在無差別檢測比對得到的數(shù)據(jù)中,10個菌都可以檢出,但是比例與數(shù)字PCR也有同樣的差異。

 

然而作為一款質(zhì)控品,無論是數(shù)字PCR還是mNGS的方法,不同提取方法,均可以做到陽性的檢出。

 

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科佰可以定制更多不同組合的病原質(zhì)控品、參考品,依照客戶的要求選擇具有代表性的細菌、真菌、DNA病毒、RNA病毒等,歡迎大家來詢。

 

 



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