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密度梯度離心法分離淋巴細胞的原理
閱讀：1422 發(fā)布時間：2022-9-21
密度梯度離心法分離淋巴細胞的原理是：常用來分離人外周血單個核細胞（PBMC）的分層液比重是1.077±0.001的聚蔗糖（Ficoll)-泛影葡胺（Urografin)(F／H)分層液。Ficoll是蔗糖的多聚體，呈中性，_W水性高，平均分子量為400,000，當密度為1.2g／ml仍未超出正常生理性滲透壓，也不穿過生物膜。
紅細胞、粒細胞比重大，離心后沉于管底；淋巴細胞和單核細胞的比重小于或等于分層液比重，離心后漂浮于分層液的液面上，也可有少部分細胞懸浮在分層液中。吸取分層液液面的細胞，就可從外周血中分離到單個核細胞。
方法：
1、在短中管中加入適量淋巴細胞分離液。
2、取肝素抗凝靜脈血與等量Hank's液或RPMI1640充分混勻，用滴管沿管壁緩慢疊加于分層液面上，注意保持清楚的界面。水平離心2000rpm×20分鐘。
3、離心后管內(nèi)分為三層，上層為血漿和Hank's液，下層主要為紅細胞和粒細胞。中層為淋巴細胞分離液，在上、中層界面處有一以單個核細胞為主的白色云霧層狹窄帶（如下圖），單個核細胞包括淋巴細胞和單核細胞。此外，還含有血小板。
4、用毛細血管插到云霧層，吸取單個核細胞。置入另一短中管中，加入5倍以上體積的Hank's液或RPMI1640，1500rpm×10分鐘，洗滌細胞兩次。
5、末次離心后，棄上清，加入含有10％小牛血清的RPMI1640，重懸細胞。取一滴細胞懸液與一滴0.2％臺盼蘭染液混合，于血球計數(shù)板上，計數(shù)四個大方格內(nèi)的細胞總數(shù)。