理想的波長會根據(jù)肽的結構而變化。選擇具有最高靈敏度的波長是理想的，同時避免引入過多噪聲或遺漏某些化合物。如果210 nm過于嘈雜，那么214 nm通常會提供一個更干凈的基線。環(huán)狀結構在280 nm處吸收最好，雙鍵在254 nm處，單鍵在210 nm處。推薦的通用波長對于蛋白質(zhì)和肽是210 nm。

反離子

為了提高肽和柱的性能，通常使用反荷離子。這有助于提供更均勻的分離，從而改善柱性能。常用的反荷離子是0.1%（體積比）三氟乙酉夋（TFA）。將其等量添加到A和B移動相中。在整個分離過程中保持穩(wěn)定反荷離子濃度會得到更一致的基線。簡單的配制方法是每升移動相中加入1毫升（0.1% v/v）。直接用移液管將TFA加入到移動相中并彳切底混合。

柱負載

這個參數(shù)根據(jù)肽的組成有很大的變化。對于4.3克的RediSep反相柱，0.5毫克應該是一個好的起點。

柱構造

柱本身由三個主要部分組成：

1. 支持介質(zhì)是固定相所綁定的固體表面。

2. 固定相是附著在支持介質(zhì)上的活性涂層，即C18。

3. 移動相是流過支持介質(zhì)的流體，以便將肽的活性部分暴露給固定相。

移動相或溶劑系統(tǒng)

許多肽強烈地吸附在C18上，通常需要一個強梯度來洗脫。典型地，水用作溶劑A，乙腈用作溶劑B來洗脫肽。

梯度

在建立新方法時，通常建議創(chuàng)建一個從0到95% B溶劑的非常緩慢的梯度，以確保所有峰都被洗脫并且柱子被清潔。

在初始的0-95%梯度運行后，洗脫輪廓大致確定，可以根據(jù)特定肽的需要修改梯度。通過在特定的保留時間改變梯度的斜率，可以優(yōu)化分離時間和峰形。

三、分析結果

圖1提供了一個參考肽的色譜圖。特定的肽是使用表1中列出的參數(shù)進行分離的。參數(shù)將隨著肽的結構而變化。

【ISCO】反相RediSep®柱在肽分離中的應用與優(yōu)化

圖1：樣品肽色譜圖

四、總結

肽的純化方法可以先在較小的柱上建立，然后根據(jù)所需的樣品負載量進行放大。

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