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翌圣生物科技（上海）股份有限公司
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產品簡介
產品介紹
Cy3 NHS Ester Cy3-N-羥基琥珀酰亞胺酯
產品信息
產品名稱 | 產品編號 | 規格 | 儲存 | 價格（元） |
Cy3 NHS Ester Cy3-N-羥基琥珀酰亞胺酯 | 40777ES03 | 1mg | -20℃避光干燥保存 | 2938.00 |
產品描述
Cyanine 3（Cy3），是花青素熒光素染料家族的成員之一，是化學合成的聚甲炔染料。目前Cyanine系列染料以兩種異構體的形式供貨，一種是非磺化花青素（non-sulfonated cyanines），一種是磺化花青素（sulfonated cyanine）。兩者的光譜性質幾乎*，因此大部分應用可相互替換，比如，都可用于標記DNA或蛋白等生物分子。兩者的主要區別在于：磺化染料是水溶性的，在水相的標記反應體系內不需要使用有機共溶劑，并且降低染料在水中聚集的可能性，增強標記效率。
本Cyanine 3（Cy3）是以磺化染料的形式供貨，易溶于水，Ex=555 nm，Em=565 nm，具有明亮熒光，光穩定性強，pH非敏感性等優點，適用于標記多肽、蛋白以及核酸等生物分子，以通過后續熒光成像以及其他熒光生物學方法分析目的蛋白。
本Cy3 NHS ester，即含N-羥基琥珀酰亞胺（N-Hydroxysuccinimide）活化基團的Cy3，可直接與生化分子上的氨基（-NH2）反應形成穩定的酰胺鍵，主要是伯胺。
產品性質
英文別名（English Synonym） | Cyanine 3, monosuccinimidyl ester |
分子量（Molecular Weight） | 829.03 |
外觀（Appearance） | 紫色固體 |
Ex/Em | 555nm/565nm |
溶解性（Solubility） | 溶于DMSO，DMF，水 |
結構式（Structure） |
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運輸和保存方法
冰袋運輸。-20℃干燥避光保存，有效期1年。
注意事項
1）NHS ester基團對濕度非常敏感，務必干燥保存產品。使用前產品需放到室溫回溫至少20min。
2）NHS ester基團的水解發生在水溶性緩沖體系屬于競爭性反應。對蛋白/多肽（濃度：1-1mg/ml）伯胺的連接反應建議在pH 7-9范圍內進行。使用不含氨基的緩沖體系，pH 7-9。比如100 mM 磷酸鈉，150 mM 氯化鈉， pH 7.5； 100mM Hepes, pH 7.5。100 mM 碳酸鈉/碳酸氫鈉, pH 8-9；或100mM 硼酸緩沖液, pH 8-9。
3）不要使用含伯胺的任何緩沖液，比如Tris，甘氨酸。
4）為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
使用方法（用Cy3-NHS Ester 標記抗體）
【注意】：可參考本方法進行多肽，蛋白或者其他分子的標記，需要根據具體的實驗體系對合適的標記緩沖體系，樣本濃度，染料濃度等參數做出合適的調整。
1）用不含氨基的合適的緩沖液（eg.100mM磷酸鈉，150mM NaCl, pH7.5）溶解抗體使其濃度達到1-5mg/ml。【注】：如抗體中有殘留Tris或 glycine 污染，則需透析或者脫鹽到合適的緩沖液內。
2）使用前，用適量去離子水或者無水DMSO溶解Cy3-NHS，使其摩爾濃度為抗體摩爾濃度的400倍，例如，待標記的IgG濃度為1mg/ml（eg 6.7μM），則溶解后Cy3-NHS的濃度為2.7mM；如待標記的IgG濃度為2.5mg/ml，則溶解后Cy3-NHS的濃度為6.75mM；
3）向抗體中加入適量Cy3-NHS試劑，以達到預期的標記效率。【注】：當用Cy 3 NHS ester標記抗體或其他蛋白，亮度zui高的偶聯物其染料/蛋白的比率為4-12，取決于特定的應用。過高比率會增加非特異性背景，喪失抗體特異性結合，導致聚集。建議根據應用優化標記比率。
4）室溫孵育60min（或更長）；
5）利用合適緩沖液透析或脫鹽柱去除未反應的試劑；
6）分別在280nm和550nm檢測Cy3-抗體的吸光值；
7）測定Cy3標記效率（DOL）和標記濃度。見下公式。
公式一. 利用下面公式計算Cy3標記效率（DOL）及其濃度（mg/ml） |
Eq.1 Number of Cy3 dye per protein=molarity Cy3 dye / molarity protein |
Eq.2 [Molarity of Cy3 dye]=A555/ε555 |
Eq.3 [Molarity of protein]=A280C/ε280 |
Eq.4 mg/ml=[A280-(A555×0.08)/(E1%/10)]×dilution factor |
【注】上述參數如下： A555=conjugate absorbance at 555±2nm ε555=molarextinction coefficient Cys dye =150000M-1cm-1 A280= conjugate absorbance at 280nm A280C =corrected conjugate absorbance at 280nm= A280-( A555×0.08) ε280= molarextinction coefficient protein(M-1cm-1)=MWp×E1%/10 |
應用舉例
用高于抗體摩爾濃度20倍的Cy3-NHS標記 0.1 ml山羊IgG（濃度為1mg/ml）。標記后脫鹽去除未標記染料，在PBS中測定(1:5稀釋)測定其A280和A555:
A280=0.2906
A555=0.9825
另：山羊IgG分子量為150kDa, E1%=13.6 or 204000M-1cm-1
計算DOL如下：
By Equation 2 Molarity of Cy3 dye=0.9825/150000 M-1cm-1=6.55μM
By Equation 3 Molarity of IgG =0.2906-(0.9825×0.08)/204000 M-1cm-1=1.039μM
By Equation 1 number of Cy3 per IgG=6.55μM/1.039μM=6.3
則計算Cy3-IgG protein 濃度為（mg/ml）：
By Equation 4 mg/ml=[0.2906-(0.9825×0.08)/1.36]×5=0.78mg/ml
