關鍵字：Tn5、ATAC-Seq、LIANTI、單細胞

高通量測序（NGS）技術的發展以及實驗通量的不斷增加，要求NGS上游樣本處理步驟盡可能簡便，以提高NGS整個流程的工作效率。轉座系統具有快速“剪切、粘貼”、“復制、粘貼”的功能，已被創新應用于NGS領域，如ATAC-Seq（Assay for Transposase-Accessible Chromatin with highthroughput sequencing，利用高通量測序檢測轉座酶易接近的染色質），LIANTI（Linear Amplification via Transposon Insertion，通過轉座子的線性放大），單倍體分型，結構變異檢測等，不僅簡便，有效縮短NGS樣本建庫時間，實現規?；焖贉y序，提高測序分辨率，同時能夠被靈活改造，應用于更多的技術創新。

圖  移花接木——剪切，粘貼

1. 轉座因子的發現

20世紀40年代，美國遺傳學家芭芭拉.麥克林托克（Barbara McClintock）在某些玉米籽粒中發現了玉米色素顯現著一些稀奇古怪的模式。她觀察到玉米籽粒顏色的遺傳很不穩定，有時籽粒上還出現一些斑斑點點。通過耐心的記錄和仔細的分析，她發現使籽粒著色的色素基因是在某一特定代上“接上”或“拉斷”的。1951年，在冷泉港生物學專題討論會上，麥克林托克遞交了自己的學術論文，向科學界同行報告了她的新理論，提出遺傳基因可以轉移，能從染色體的一個位置跳到另一個位置，甚至從一條染色體跳到另一條染色體上。她把這種能自發轉移的遺傳基因稱為“轉座因子”，并于1983被授予諾貝爾醫學獎。

轉座因子的發現改變了人們對基因組序列穩定性的認識。自此以后，人們已經在生物界各個領域證實了轉座子系統的廣泛存在，并將轉座子系統開發成為各種生物基因分析的有效工具之一，極大促進了遺傳學的發展。

圖  Barbara McClintock

轉座因子（轉座子）根據其功能是“復制-粘貼”還是“剪切-粘貼”分為I型轉座子和II型轉座子兩類。I型轉座子的轉座中間體是RNA，II型轉座中間體是DNA。II型轉座子，尤其是來源于細菌的Tn5轉座子，是NGS領域zui常用的轉座子。

2. 轉座子Tn5的轉座事件

Tn5轉座子是一種細菌轉座子，zui早由E. coli中發現，是一段含有若干抗性基因和編碼轉座酶基因的DNA片段（a）。其中IS50R和IS50L的序列高度同源，只是IS50L的一個堿基存在突變。IS50具有19bp的倒置末端（外末端outside end，OE和內末端inside end，IE），兩末端倒置有7個堿基不同。此倒置末端是轉座酶（Tnp）的作用位點。IS50L和IS50R均含有編碼轉座酶（TnP）以及轉座阻遏蛋白（lnh）的基因，但由于IS50L中的堿基突變，造成翻譯提前終止，所以僅有IS50R可以產生正常的有活性的TnP和lnh。

圖 Tn5轉座子結構

轉座事件發生時，兩個轉座酶（Tnp）分子（綠色標注）結合到Tn5轉座子的OE末端（黃色標注），形成兩個Tnp-OE復合體，隨后兩個復合體通過Tnp的C末端相互作用進行聯會，形成一個Tn5轉座復合體，此時Tnp產生切割DNA的活性。隨后Tnp利用切割活性，經過一系列化學反應切除供體DNA，離開供體鏈。當結合到靶DNA上時，Tn5轉座復合體識別并攻擊靶序列（Target site），將轉座子插入到靶序列中，粘性末端通過DNA聚合酶、連接酶作用進行填補，兩端形成9bp正向重復序列。整個轉座過程完成了基因從原始DNA被剪切之后粘貼在另一受體DNA的過程，實現了基因的“跳躍”。

圖 Tn5轉理

3. 轉座子Tn5用于NGS文庫構建

NGS文庫構建即把DNA樣本片段化或篩分成長度的目標序列，再加上寡核苷酸接頭P5、P7（和條形碼Barcode），用于后續測序上機。傳統建庫方式需要經過DNA片段化、末端修復、接頭連接、文庫擴增、多次純化分選等步驟，耗時較長，將Tn5用于測序文庫構建時，可將DNA片段化、末端修復、接頭連接等多步反應轉變為1步反應，極大縮短建庫時間，提高工作效率。

Tn5用于NGS建庫的體外轉座要素包含：轉座子的末端序列、靶DNA、轉座酶（Tnp）和Mg²⁺（激活劑），轉座法建庫形成的文庫結構如下：

圖 轉座法建庫文庫結構

將P5、P7端部分接頭序列（Adapter 1/2）+轉座子末端序列設計合成供體DNA，Tnp識別轉座子末端形成帶有P5、P7端部分接頭的Tn5轉座復合體（見下圖）。該復合體識別受體DNA的靶序列（Target site），切斷受體DNA，并插入攜帶的供體DNA，形成一端帶有P5部分接頭Adapter 1，一端帶有P7部分接頭Adapter 2的DNA，之后通過PCR加上Barcode以及接頭其余部分，形成含P5端與P7端完整接頭的DNA文庫。

圖 Tn5轉座系統用于文庫構建

4. Tn5轉座的前沿應用

1）ATAC-Seq

ATAC-seq，全稱為Assay for Transposase-Accessible Chromatin with highthroughput sequencing，即利用高通量測序檢測轉座酶易接近的染色質）的技術。真核生物的核DNA并不是裸露的，而是有蛋白質即組蛋白與之相結合的。DNA一圈一圈得纏繞在組蛋白上，形成串珠式的結構。而這樣的結構還能夠進一步折疊、濃聚，并在其他架構蛋白的輔助下，形成染色體。當需要進行DNA的復制或者轉錄時，DNA的折疊結構會被打開形成可接近區域，此時，ATAC-seq技術使用Tn5轉座酶進入并切割下暴露的DNA并同時連接上特異性的Adapters，連接上Adaptors的DNA片段被分離出來用于二代測序，從而獲得大量的細胞系和組織樣本基因表達、轉錄調控、轉錄修飾等的信息。相對其他如MNase-seq，FAIRE-seq和DNase-seq等染色質研究方法來說，ATAC-seq具有快速、樣本需求量少、一次性獲得全基因組上的染色質開放區域等優勢，在表觀遺傳學具有廣闊的發展前景。

圖 ATAC-seq原理

延伸閱讀：

[1] Buenrostro JD, Giresi PG, Zaba LC, Chang HY, Greenleaf WJ. Transposition of native chromatin for multimodal regulatory analysis and personal epigenomics. Nature methods. 2013;10(12):1213-1218. doi:10.1038/nmeth.2688.

[2] Buenrostro, JD., Wu, B., Chang, H. Y.&Greenleaf, W. J. ATAC-seq: A Method for Assaying Chromatin Accessibility Genome-Wide. Curr. Protoc. Mol. Biol. 109, 21.29.1-9 (2015).

[3] Combining ATAC-seq with nuclei sorting for discovery of cis-regulatory regions in plant genomes. Nucleic Acids Research, 2017.

2）LIANTI

LIANTI，全稱為Linear Amplification via Transposon Insertion，即通過轉座子的線性放大，是一項經過改良的單細胞全基因組擴增（whole-genome amplification，WGA）方法。 LIANTI法首先利用Tn5轉座子結合LIANTI序列，形成Tn5轉座復合體（含T7啟動子），之后該復合體隨機插入單細胞基因組DNA，經轉座后，將DNA隨機片段化并連接T7啟動子。隨后T7啟動子行使體外轉錄功能，用轉錄獲得大量線性擴增的轉錄本，轉錄本再經過逆轉錄之后得到大量的擴增產物，隨后進行正常的建庫測序操作。整個過程僅進行線性擴增，沒有進行指數擴增，大大增強了擴增穩定性，降低PCR干擾，此外，該技術將該放法將測量拷貝數的空間分辨率提高了3個數量級（能在千堿基分辨率進行微CNV檢測，基因組覆蓋率可達到97%），助力更有效、更地檢測出更多遺傳疾病。

圖 LIANTI原理

延伸閱讀：

[1] Chen, C., Xing, D., Tan, L., Li, H., Zhou, G., Huang, L., & Xie, X. S. (2017). Single-cell whole-genome analyses by Linear Amplification via Transposon Insertion (LIANTI). Science, 356(6334), 189-194.

5. 結語

轉座參與的普通建庫技術，有效縮短了建庫時間，滿足了測序市場對大規模樣本處理速度的需求，而轉座參與的特定研究方向建庫技術，如ATAC-Seq、LIANTI、CPT-seq等，則更多的滿足了科研人員們對于科學研究的需求。目前轉座子/轉座酶的技術應用在NGS領域還只是冰山一角，相信未來轉座酶/轉座子的可改造性會為NGS提供了更多的可能。

6. 參考文獻

Single-cell whole-genome analyses by Linear Amplification via Transposon Insertion (LIANTI).

ATAC-seq: A Method for Assaying Chromatin Accessibility Genome-Wide.

Transposons Tn10 and Tn5.

Structure/function insights into Tn5 transposition.

Transposons: DNA.

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