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小鼠模型是結腸炎造模常見模型，自從1985年采用葡聚糖硫酸鈉(dextran sulphate sodium, DSS)制備出倉鼠潰瘍性結腸炎模型后，已有大量數據證明DSS結腸炎模型的病因、臨床癥狀、病理改變及治療應答均與人類潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis，UC)相似。

DSS造模優勢

葡聚糖硫酸鈉鹽（Dextran Sulfate Sodium Salt, DSS）是一種聚陰離子衍生物，其誘導結腸炎模型的機制雖仍未十分明確，但通常認為與巨噬細胞功能失調、腸道菌群失調、DSS對結腸上皮的毒性作用、細胞因子在DSS結腸炎模型的發病中起重要作用等機制有關。

 對比多種UC建模類型，DSS造模具有很大優勢：

1. 癥狀與人類UC高度相似：可用于研究結腸炎發生機制和藥效研究；

2. 成模率高：自由飲用DSS水溶液，簡單易行、重復性強；

3. 可構建多種結腸炎模型：急性結腸炎、慢性結腸炎，還可以聯合AOM構建結腸炎相關性癌癥（CAC）模型；

4. 適用于多種屬動物造模：小鼠、大鼠、斑馬魚、豬、果蠅等；

5. 安全性高：DSS可被自然生態系統降解，對環境安全。

Yeasen提供高品質DSS（Cat#60316ES）：高純度，硫含量17-19%，游離硫＜0.2%，產品有大量文獻數據支持。

案例1 葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導的小鼠結腸炎

1. 實驗方案

實驗動物：8周齡的BALB/c小鼠。

實驗組：2.5% DSS飲用水，持續7天。

對照組：飲用水。

實驗結果：小鼠發展成結腸炎，表現為結腸變薄變短且上皮糜爛和潰瘍、隱窩膿腫、杯狀細胞喪失、粘液層喪失和大量嗜中性粒細胞滲入固有層。

圖1 DSS誘導的小鼠腸道炎癥

結腸圖片；B.結腸的內窺鏡檢查；C. H&E染色的結腸切片；

箭頭指示：1. 縮短和出血的結腸；2. 脾臟腫大；3. 淺表性炎癥；4. DSS處理小鼠的上皮侵蝕和免疫細胞浸潤）

2. 詳細實驗步驟

2.1稱重標記的對照組和實驗小鼠組

在DSS給藥的當天(第0天)，應稱重標記對照組和實驗小鼠組；DSS給藥前收集的糞便可用作檢測炎癥糞便標記物時的對照。用高壓滅菌水制備DSS水溶液，對照組小鼠應該得到相同量的水，但不含DSS。【注】通過測量剩余水觀察各組小鼠的水攝入量。

每天測量體重以及潛血的存在，用以下評分系統用于腸出血的比較分析。

2.2收集糞便

將單只小鼠放置在沒有墊料的空籠子中15-30 min收集糞便。隨著DSS給藥的繼續和炎癥變得更加嚴重，收集所需的時間將會增加。用無菌鑷子，將糞便收集在微量離心管中，并用一個小球監測潛血。【注】用于測量炎癥標記物的糞便應-20℃凍存。

在開始出血的前三天，體重可能會稍微增加，然后開始逐漸減少。沒有硬性規定DSS應該給藥7天，需由研究者根據顯著的體重減輕和血性腹瀉來決定何時處死小鼠。

2.3觀察結腸粘膜損傷

對DSS誘導的結腸粘膜損傷進行體內直接觀察。在1.5-2.0%異氟烷麻醉下，用空氣膨脹結腸后，可以看到3 cm的近端結腸，可通過評估以下內容對內窺鏡損傷進行評分。

2.4研究上皮細胞的增殖遷移與腸滲透性

在處死前4h和24h，可給小鼠腹膜內注射BrdU，通過對BrdU進行組織學特異性染色來監測腸上皮細胞的增殖和遷移。

處死當天，小鼠應禁食4h，灌胃給予溶于0.1 mL PBS中的FITC-Dextran(4或40 KDa，0.6 mg/g體重)，3h后放血收集無溶血的血清。腸滲透性與適當稀釋的血清的熒光強度相關（激發488 nm；發射520 nm），通過在小鼠血清中連續稀釋已知量的FITC-Dextran來制備FITC-葡聚糖的標準曲線。

【注】為了對腸道炎癥進行定量測量，可通過ELISA試劑盒測量血清角質細胞衍生趨化因子(KC)和/或脂質運載蛋白2(與疾病活動相關)。因此，KC以1:2或1:4稀釋對照血清樣品，脂質運載蛋白2以1:200稀釋對照血清樣品，來自DSS處理的小鼠的樣品需要更高的稀釋度。

2.5脾臟、結腸稱重以及結腸長度測量

噴灑70%乙醇，通過腹部中線切口小心地打開小鼠肚子，取出脾臟。脾臟重量的增加通常與炎癥和貧血的程度相關。

在收集結腸之前，如果計劃研究腸系膜淋巴結的增大、表征免疫細胞群和/或分析與DSS誘導的病理學相關的腸道細菌移位，則應分離腸系膜淋巴結。

用鑷子提起結腸，小心地拉，直到可以看見盲腸。將結腸和盲腸從回盲部的小腸和直腸遠端的中分離出來。此時，可以拍攝所有小鼠組或每組一名代表從盲腸到直腸的腸的大體照片。測量長度，拉直結腸，但不要拉伸。然后可以將結腸從盲腸中分離出來，并使用冷PBS快速沖洗以除去糞便和血液。盲腸可以廢棄，因為DSS在該區域很少或沒有誘導炎癥。

【注】用PBS沖洗后，可以取結腸重量。根據觀察到的組織消耗，嚴重發炎的結腸顯示出重量減輕。

2.6結腸過氧化物酶(MPO)檢測

結腸MPO是中性粒細胞的標志，其在組織中的濃度與中性粒細胞浸潤的程度相關。稱量結腸組織(50-100 mg )，并在PBS中清洗，直到沒有糞便物質，并在-80°C下儲存，直到進行分析。

2.7qRT-PCR分析

將一片結腸(50 mg)置于RNAlater中，直到提取RNA。對于更長時間的儲存，RNAlater中的組織應在-20℃下冷凍。在提取RNA的當天，從RNAlater中去除結腸，并通過標準程序提取RNA。由于已知結腸組織中的微量DSS會干擾PCR擴增，因此有必要通過氯化鋰法去除所有多糖，包括DSS。

2.8組織學染色

縱向切開每一片結腸，用PBS浸濕的牙簽包住，放入盒中。在10%福爾馬林緩沖液中固定24h后，轉移到70%乙醇中直到分析。對于使用特定抗體的特殊染色(如免疫組織化學、免疫熒光)，建議將冷凍切片固定在防凍包埋介質OCT中。如果研究粘蛋白層和細菌粘附/移位，不要用PBS沖洗結腸，并浸入Carnoy溶液中，因為這可以保留粘液結構。福爾馬林固定的結腸組織可以使用BrdU抗體進行BrdU染色。其次，Ki67可用于測量上皮細胞增殖。

組織學評分：可以以如下方式對H & E染色的結腸組織進行組織學評分。根據粘膜、粘膜下層和肌層/漿膜的上皮損傷和炎性浸潤的程度，給每個切片分配四個分數。如果是局部性改變，都乘以1，如果是斑片狀改變，都乘以2，如果是彌漫性改變，都乘以3。最后將每個結腸的4個單獨得分相加，得到每個小鼠的總得分范圍為0-36。

2.9體外培養洗滌的菌落

縱向切開的結腸(約1.0 cm)應在HBSS中用1.0%抗生素(青霉素和鏈霉素)連續清洗三次。將洗滌過的菌落置于含有1.0 mL無血清RPMI1640培養基和1.0%抗生素(青霉素和鏈霉素)的孔(24孔板)中，并在37°C和5.0% CO2下孵育24h。收集上清液，在4°C離心10 min，并在-80°C下儲存，直到分析促炎細胞因子。

【注】DSS誘導的結腸炎的成功和可重復誘導取決于許多關鍵因素，包括DSS來源、批號、分子量、濃度、持續時間、小鼠品系、來源、年齡、性別和體重以及環境因素，包括動物飼養所的衛生條件。如果觀察到高死亡率，表明對DSS高度敏感，應減少DSS的劑量。如果未觀察到結腸炎或結腸炎較輕，表明易感性較低，應考慮增加DSS濃度/和/或持續時間。

3實驗結論

DSS結腸炎模型在理解腸道炎癥的病理生理學方面有很重要的作用，為活性IBD的理論和臨床認識提供了依據。DSS結腸炎模型可以用來研究日益復雜的腸道環境的任何方面的貢獻，或評估旨在預防或改善疾病的干預措施。DSS誘導的結腸炎模型將繼續為宿主遺傳、腸道先天免疫、微生物群、飲食和其他環境因素在維持胃腸道穩態之間的相互作用提供有價值的機制線索。

4其他注意事項

1）小鼠選擇

成功且容易復制的DSS結腸炎誘導的最佳年齡在6-8周之間，優選8周齡。推薦C57BL/6J和BALB/c小鼠，因為它們在文獻中普遍存在。

2）建議盡可能少地更換籠子

因為鼠類的糞食作用有助于關鍵營養物質的再循環。每天更換籠子可能會導致食物和水的消耗增加。如果任何籠子需要更換，所有組的籠子應同時更換。

3）最好在給藥當天制備DSS水

DSS水應在服用前用磁力攪拌棒混合并溶解，未溶解的鹽可能會堵塞水瓶的出水口或影響水的攝入，從而可能導致錯誤的結果。制備DSS溶液時，最好使用高壓滅菌水，對照組應該喝同樣的水。

4）建議先做預實驗

建議先做預實驗，2-3個濃度，每個濃度2-3只小鼠，選取最佳的DSS劑量。

案例2 DSS誘導的結腸炎與脂肪組織和肝臟脂質代謝的相關研究

1實驗方案

1.1 8周齡C57BL/6L雄性小鼠

實驗組：1%、2%和3% 的DSS水持續7天，飲用水持續7天，共3個循環。

對照組：飲用水。

實驗結果：小鼠發展成結腸炎，表現為體重顯著下降和疾病活動指數（DAI）評分顯示的結腸炎嚴重程度顯著增加，DSS處理的小鼠還表現出與緊密連接功能和粘液層形成相關的基因表達顯著降低，DSS處理的小鼠結腸切片顯示顯著的全層炎癥，炎癥評分增加，隱窩損傷、免疫細胞浸潤到固有層以及上皮和粘膜結構的改變。

圖2 DSS誘導的小鼠慢性結腸炎

（A.實驗方案；B.體重變化；C.疾病活動指數（DAI）的變化；D.結腸重量；E.結腸長度；F.閉鎖蛋白的蛋白表達；G.緊密連接蛋白；M.結腸段和結腸組織的H&E染色代表性圖像和結腸組織以及代表炎癥評分的圖表）

1.2 18周齡C57BL/6L雄性小鼠

實驗組：慢性DSS誘導的結腸炎組（2% DSS）和急性DSS誘導的結腸炎組（3% DSS）。對于慢性DSS誘導的結腸炎，DSS處理組需要3個周期，每個周期包含5天的DSS飲用水和5天的飲水恢復期；對于急性DSS誘導的結腸炎，小鼠接受了7天的DSS治療，隨后是3天的飲水恢復期。

對照組：飲用水。

實驗結果：小鼠發展成結腸炎，表現為體重顯著下降和疾病活動指數（DAI）評分顯示的結腸炎嚴重程度顯著增加，DSS處理的小鼠還表現出與緊密連接功能和粘液層形成相關的基因表達顯著降低，DSS處理的小鼠結腸切片顯示顯著的全層炎癥，炎癥評分增加。

圖3 DSS誘導的老年小鼠結腸炎

（A.實驗方案；B.體重變化；C.疾病活動指數（DAI）的變化；J.結腸段和結腸組織的H&E染色代表性圖像和結腸組織以及代表炎癥評分的圖表；K.小鼠的組織重量；L.肝切片H&E染色代表性圖像；M.總膽固醇、高密度脂蛋白和低密度脂蛋白膽固醇水平）

2詳細實驗步驟

2.1 DSS誘導小鼠結腸炎模型

8周齡的小鼠設置：0（陰性對照組），1%，2%，和3%（w/v）DSS處理組。DSS處理組需要3個周期，每個周期包含7天的DSS飲用水和7天的飲水恢復期。

18周齡的雄性小鼠設置：非DSS處理對照組，慢性DSS誘導的結腸炎組（2% DSS）和急性DSS誘導的結腸炎組（3% DSS）。對于慢性DSS誘導的結腸炎，DSS處理組需要3個周期，每個周期包含5天的DSS飲用水和5天的飲水恢復期。對于急性DSS誘導的結腸炎，小鼠接受了7天的DSS治療，隨后是3天的飲水恢復期。

【注】在DSS治療和恢復周期期間，每天記錄體重、糞便硬度以及直腸或糞便中的出血情況。

2.2結腸炎嚴重程度的評估

2.2.1疾病活動指數（DAI）評分

DAI由體重相對下降、糞便硬度和直腸或糞便中的血液等因素決定。

體重下降評分

糞便硬度評分

直腸/糞便出血評分

2.2.2蘇木精和伊紅（H&E）染色進行組織形態學評估

新鮮結腸組織用冷PBS洗滌，縱向切成3部分，其中一部分在PBS緩沖的10%甲醛中固定，包埋在石蠟中，然后切成5 μm厚的切片進行H&E染色。使用光學顯微鏡觀察炎癥跡象、細胞浸潤、纖維化以及上皮和粘膜損傷，以評分組織形態。

組織形態的評分如下：高倍視野（400×）的炎癥細胞（如多形核白細胞、淋巴細胞、漿細胞、巨噬細胞和巨大細胞）數量評分：0分（正常組織）；1分（罕見，1-5/phf）；2分（輕微增加，5-10/phf）；3分（更明顯的增加）；4分（顯著增加，密集）。

白細胞浸潤的程度評分：0分（罕見，1-5/phf）；1分（固有層顯著增加，5-10/phf）；2分（粘膜下部分融合）；3（全層浸潤）。

纖維化的嚴重程度評分：0分（正常）；1分（輕微）；2分（中等）；3分（嚴重）；4分（非常嚴重）。

上皮損傷評分：0分（正常組織）；1分（失去基底三分之一的隱窩）；2分（失去基底三分之二的隱窩）；3分（整個隱窩喪失）；4分（局灶性侵蝕）；5分（融合性侵蝕）。

粘膜損傷評分：0分（正常組織）；1分（1或2個潰瘍灶）；2分（3或4個潰瘍灶）；3分（融合或廣泛潰瘍）。

2.2.3血漿分析

通過心臟穿刺獲取新鮮血液，收集在采血管中，然后在18°C下以15000 g離心5 min，分離出的血漿在-70°C下冷凍直至分析。測量血漿中的甘油三酯（TG）、總膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇（HDL）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL）、AST和ALT水平，使用試劑盒測量血漿脂多糖（LPS）水平。

2.2.4實時逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）

提取總RNA，并將2 μg提取的RNA進行逆轉錄合成互補DNA，使用qPCR Master Mix試劑進行實時熒光定量PCR。對酸性核糖體磷酸蛋白（Arbp）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）、ZO-1、咬合蛋白、MUC2、MUC13、白細胞介素17（IL-17）、腫瘤壞死因子α（TNFα）、IL-1β、干擾素γ（IFNγ）、IL-4、IL-6、IL-22、IL-23、F4/80、CCAAT增強子結合蛋白同源蛋白（CHOP）、脂聯素、脂聯素受體1（AdipoR1）、AdipoR2、載脂蛋白A1（ApoA1）、ApoB、微粒體甘油三酯轉移蛋白（MTP）、肝X受體α（LXRα）、膽固醇7α-羥化酶（CYP7A1）、CYP7B1、CYP27A1、CYP8B1等的基因轉錄本進行定量。每個基因的相對表達水平使用ΔΔ Ct方法計算，并標準化為Arbp或GAPDH的表達。

2.2.5肝組織組織學分析

肝組織標本在10%緩沖甲醛中固定，包埋在石蠟中，切成5 μm厚度，并用蘇木精和伊紅（H&E）染色，在光學顯微鏡下以400倍放大獲取圖像。使用甘油三酯（TG）測定試劑盒測定肝臟中的甘油三酯（TG）水平。

2.2.6蛋白印跡分析

針對AMPK、BiP、CD36、CHOP、FAS、FGF21、HSL、咬合蛋白、磷酸化AMPK（Tr172）、磷酸化HSL（Ser563）、SCD1、UCP1、β-actin和GAPDH的抗體作為一抗，其次是抗兔IgG-HRP偶聯的二抗。免疫印跡通過ECL進行可視化，并使用ImageJ軟件進行密度分析。

3 實驗結果

急性或慢性硫酸葡聚糖（DSS）處理的年輕和老年小鼠都發展出了結腸炎，這通過體重下降、結腸長度縮短、疾病活動指數和炎癥評分升高得到證實。它們還顯示出與腸道屏障功能相關的蛋白表達降低和血漿脂多糖水平升高，這表明DSS誘導的屏障功能障礙和隨之而來的通透性增加。結腸炎小鼠它們呈現出肝臟內脂肪積聚以及血脂水平異常的特征。這種DSS誘導的結腸炎相關脂質代謝功能障礙是由于包括脂肪酸氧化、脂質生成、脂解、膽固醇逆向運輸、膽汁酸合成以及白色脂肪組織褐變和棕色脂肪組織產熱在內的整體代謝過程的破壞，這些過程大多數是通過能量穩態的關鍵調節因子如FGF21、脂聯素和irisin，通過SIRT1/PGC-1α和LXRα依賴性途徑介導的。

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