聯系電話
翌圣生物科技（上海）股份有限公司
初級會員·13年
- 聯系人：
- 曹女士
- 電話：
- 400-6111-883
- 手機：
- 售后：
- 4006-111-883
- 傳真：
- 86-21-34615995
- 地址：
- 上海市浦東新區天雄路166弄1號3樓
- 網址：
- www.yeasen.com
掃一掃訪問手機商鋪
巨噬細胞清除劑（Clodronate Liposomes）
——體內巨噬細胞清除利器，高效、迅捷
巨噬細胞的清除（Depletion of macrophages），是全面了解巨噬細胞在病理條件下功能的一種十分有力的研究方法，氯膦酸鹽脂質體（Clodronate Liposomes）是目前最為成熟，方便，經濟的一種巨噬細胞清除工具，可以有效的清除動物體內不同組織部位和血液中的巨噬細胞。
氯膦酸二鈉（Clodronate）是一種雙膦酸鹽藥物，在臨床上主要用于癌癥引起的溶骨性骨轉移、骨質疏松癥和高鈣血癥。其作用機理是氯膦酸二鈉在細胞內代謝成不可水解的ATP類似物，抑制線粒體中的ADP/ATP轉運機制，從而阻斷線粒體呼吸鏈誘導細胞凋亡。但是該藥物親脂性低，不能跨細胞轉運，在口服或是靜脈給予游離藥物后，2小時后即可達半衰期，48小時內80%藥物隨尿液排出。
脂質體是單層或多層脂質雙分子層的球形囊泡，其主要成分是磷脂和膽固醇。脂質體本身具有雙分子層結構，組成成分無毒性，因此可以作為運輸分子物質的載體，它通過與細胞膜結合的方式將分子物質運輸到細胞內。
圖1：氯膦酸-脂質體（Clodronate liposomes）復合物
氯膦酸鹽包裹進磷脂體的水相中形成氯膦酸鹽脂質體，氯膦酸鹽不能自由的通過脂質體磷脂體雙分子層。注射到生物體內后，氯膦酸鹽脂質體會被巨噬細胞吞噬，在巨噬細胞內的溶酶體磷酸酶的作用下，溶解在脂質體內的氯膦酸鹽會被逐步釋放出來并在細胞內積累，當達到一定濃度時，巨噬細胞將會受到不可逆損傷，誘發細胞凋亡。死亡細胞內的氯膦酸鹽會被釋放到細胞外，隨尿液排出體外。
圖2：巨噬細胞清除劑原理示意圖
1 mL脂質體體懸液中所含的氯膦酸大約為5 mg，脂質體直徑為1.5-2μm。所用的磷酸鹽緩沖液為10 mM Na2HPO4，10 mM NaH2PO4，140 mM NaCl。
1、必須使用無菌操作從小瓶中取出產品，如果無菌性受損，請勿使用。
2、當靜置超過幾個小時后，脂質體可能會沉淀，在使用之前，為了確保脂質體懸浮液均勻，緩慢倒轉小瓶數次，直到懸浮液均勻，不要劇烈搖晃或震動。
3、在注射氯膦酸脂質體后數小時內，動物免疫能力開始下降，注意動物健康狀況，以防止與實驗無關的感染。
4、如果研究使用免疫缺陷小鼠預計會有很高的死亡率。
5、靜脈給藥時，請將藥物加熱至室溫（18 ℃），并去除注射器中的氣泡，緩慢注射，如果動物表現出任何異常反應，請降低注射速度。
6、脂質體應保存在4 °C，切勿冷凍。
尾靜脈注射方法：
1、將小鼠固定，拉出尾巴，小鼠的尾部有2條動脈和3條靜脈，2條動脈分別在尾部的背側面和腹側面，3條靜脈呈品字型分布，一般采用左右兩側的靜脈；
2、將紗布浸泡于約70 ℃溫水中，拿出后包裹尾巴，使尾部血管擴張并軟化表皮角質；
3、尾部靜脈注射時，以左手拇指和食指前后摁住鼠尾，留出約2 cm一段，使皮膚緊張，靜脈更為充盈，右手持1 mL針頭注射器，使針頭與靜脈平行(小于30°角)，從尾巴的下1/4處進針。開始注入藥物時應緩慢，仔細觀察，如果無阻力，無白色皮丘出現，說明已刺入血管，可正式注入藥物。
4、如需連續尾靜脈注射給藥，注射部位應盡可能從尾端開始，按次序向尾根部移動，更換血管位置注射給藥。拔出針頭后，用棉球按住注射部位輕壓1-2 min，止血。
注：以上操作方法和劑量使用僅供參考，不同的實驗請自行設計實驗方案或是參考相關文獻。
參考案例一：
圖3： 左圖是正常小鼠肝臟免疫細胞中Kupffer細胞的比例，右圖是注射Clodronate Liposomes 48小時后Kupffer細胞的比例，可以看到Kupffer細胞基本被清除[1]。
參考案例二：
圖4： 上圖是小鼠LLC細胞肺癌成瘤實驗中正常腫瘤組織中的巨噬細胞（紅色熒光），下圖是氣管灌注Clodronate Liposomes腫瘤組織中的巨噬細胞（紅色熒光），可以看出腫瘤中的巨噬細胞基本被清除[2]。
靶向器官/細胞 | 實驗方法 |
脾臟/紅髓區巨噬細胞 | 單次給藥：200 μL/小鼠（靜脈注射或腹腔注射） 長期耗竭：第一次給藥150 μL/小鼠，之后每隔兩周給藥100 μL/小鼠 |
肝臟/Kupffer細胞 | 單次給藥：200 μL/小鼠（靜脈注射或腹腔注射） 長期耗竭：第一次給藥劑量150 μL/小鼠，以后按照兩周一次給藥100 μL/小鼠 |
肺/肺泡巨噬細胞 | 靜脈注射（150-200 μL）聯合氣管或鼻內（50 μL）給藥獲得最佳效果 |
淋巴結 | 注射（100-200 μL）/小鼠，具體給藥方式可參考文獻 |
腦/小膠質細胞 | 腦室腦脊液注射，10 μL/小鼠，50 μL/大鼠 |
注：本劑量僅供參考，請根據實驗需求使用或參考文獻。
Q1:收到Clodronate liposomes后該如何操作？
A:收到氯膦酸脂質體后，如果不能馬上使用，需要放置在4 ℃冰箱。禁止凍存！使用時作為原液使用，不能進行稀釋。脂質體很容易發生沉淀，建議使用之前輕輕混勻，另外4 ℃的氯膦酸脂質體不能馬上使用，需要恢復到室溫才能進行注射。
Q2:如何將脂質體從小瓶中轉移出來？
A:從小瓶中轉移脂質體的最佳方法是使用無菌針頭注射器。這樣小瓶中剩余的脂質體懸浮液就可以保持密封和清潔。您也可以使用帶有無菌吸頭的移液器進行轉移，但最好在潔凈的環境中進行，例如在BSC罩中。
Q3: Clodronate liposomes能否用于體外巨噬細胞清除？
A:產品可以用于體外巨噬細胞的清除，但是這種方法比較適合體內實驗。主要是由于在體外培養過程中，從死亡細胞釋放的氯膦酸或者是從脂質體中“滲漏"出來氯膦酸，會一直存在于培養基中，但是在體內，氯膦酸的半衰期很短，很快就會被腎臟清除。雖然游離的氯膦酸不會進入細胞也不會進入脂質體，但是一旦他們在培養基中積累就會慢慢地進入細胞中。
Q4:在靜脈注射Clodronate liposomes后動物很快就死亡了，是什么原因？
A:一方面有可能是動物注射了不均一的脂質體懸液。建議在使用之前輕輕搖晃混勻。脂質體在體外一段時間后會發生沉降。如果在很長一段時間內需要一次注射多只動物，那么脂質體便會在注射器中發生沉淀，形成不均一懸液，這樣一來，第一只注射的計量與最后一只注射的計量就會發生明顯的變化。另外一方面有可能是脂質體剛從冰箱取出后，沒有恢復到室溫。
Q5:動物在注射Clodronate liposomes后幾天就死亡了？
A：這個可能是受到細菌的污染，體內清除巨噬細胞后會增加例如病毒粒子，細菌或者酵母感染的幾率。
Q6:靜脈注射Clodronate liposomes后大鼠脾臟/肝臟中的ED1+細胞并沒有*消失？
A：大鼠中成熟的巨噬細胞呈現ED1和ED2雙陽性，但是有一些沒有吞噬功能的或者吞噬作用小的前體細胞也是ED1+，但是呈現ED2-。因此，所有ED2+的細胞都可以被*清除，但是ED1+的細胞卻只能被部分清除，清除的比率取決于前體/成熟巨噬細胞的比例。
Q7: Clodronate liposomes沒有達到期望的效果？
A：氯膦酸脂質體都是大批量的生產，每批次都會對氯膦酸的濃度以及一些可能的污染物進行檢測，確保無誤后才會銷售給客戶。另外，脂質體容易收到溫度的影響。正確的運輸和儲存方式是4~8 ℃，懸液既不能被凍存，也不能被加熱超過30 ℃。自收到貨物起，需要在3個月內使用完，不然有可能會影響使用的效果。
Q8:在靜脈注射時，能不能增加注射的體積？
A：靜脈注射時需要依據動物的體重，不能超過0.1 mL/10 mg，但是進行腹腔注射可以適當的增加注射的體積。皮下注射需要根據注射位點的容量進行決定。
Q9:使用脂質體應注意的一些事項？
A：通過具有飽和烴鏈的脂質制備而來的脂質體實際上非常堅固，但仍需要注意以下一些事項。
①不要與有機溶劑混合，如氯仿、甲醇、乙醇、DMSO等。
②不要添加表面活性劑，除非您必須要這樣做以裂解脂質體。
③不要加熱、接近或高于脂質主相轉變溫度，除非進行藥物加載，這需要在相變溫度以上進行孵育。
產品名稱 | 貨號 | 規格 | 價格（元） |
Clodronate Liposomes（From Vrije Universiteit Amsterdam）體內巨噬細胞清除劑 | 40337ES08/10 | 5 mL/10 mL | 3152/5132 |
Control Liposomes（PBS）體內巨噬細胞清除劑空白脂質體對照 | 40338ES05/10 | 5 mL/10 mL | 1652/2252 |
Hematoxylin and Eosin Staining Kit 蘇木素伊紅（H&E）染色試劑盒 | 60524ES60 | 2×100 mL | 358 |
Prussian Blue Iron Stain Kit普魯士藍染色試劑盒（鐵染色） | 60533ES20/60 | 20 T/100 T | 388/1288 |
參考文獻：
[1]: Guan Z, Ding Y, Liu Y, Zhang Y, Zhao J, Li C, Li Z, Meng S. Extracellular gp96 is a crucial mediator for driving immune hyperactivation and liver damage. Sci Rep. 2020 Jul 28;10(1):12596. doi: 10.1038/s41598-020-69517-7. PMID: 32724151; PMCID: PMC7387550.
[2]: Li R, Yang L, Jiang N, Wang F, Zhang P, Zhou R, Zhang J. Activated macrophages are crucial during acute PM2.5 exposure-induced angiogenesis in lung cancer. Oncol Lett. 2020 Jan;19(1):725-734. doi: 10.3892/ol.2019.11133. Epub 2019 Nov 21. PMID: 31897188; PMCID: PMC6924157.
