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一夫當關，莫如雙管齊下
——聚焦熱啟動Taq DNA聚合酶雙封閉抗體
當下基于PCR技術的核酸檢測仍有其應用難點
難點→檢測試劑的穩定性
核酸檢測行業人都格外關注檢測試劑的穩定性，不管是長期儲存穩定性還是短期偏離正常保存條件的穩定性，都直接影響檢測結果的有效性。而短期偏離正常保存條件的穩定性在實際使用和運輸過程中尤為重要，比如遇到樣本量大、適配自動化、排隊等待上機等情況，反應體系需要在室溫或4℃放置，再比如遇到運輸時間長，溫度難以控制，檢測體系就暴露在風險之下。如何保證穩定性，如何確保檢測結果有效、可信，是行業關注的難點。
難點→非特異性擴增
非特異性擴增直接影響檢測結果的判讀，還消耗反應體系中的引物等物料，導致目的基因擴增失敗。試劑開發人員通過優化引物、調整鎂離子濃度和酶量、調整退火溫度等方法避免非特異性擴增，但仍需謹慎操作，稍不留意也會導致檢測失敗。
熱啟動DNA聚合酶可幫助攻克核酸檢測應用難點
目前常用抗體法熱啟動Taq DNA聚合酶幫助提升試劑穩定性和解決非特異性擴增問題。傳統的抗體法熱啟動，是利用Taq DNA聚合酶抗體封閉其5'→3'聚合酶活性，防止在低溫時錯配或引物二聚體引起非特異性擴增，在PCR預變性95℃加熱時，抗體蛋白變性，釋放DNA聚合酶活性，不影響正常擴增。利用抗體封閉聚合酶活性，可謂一夫當關，萬夫莫開。
一夫當關，莫如雙管齊下——翊圣帶來雙封閉抗體
聚合酶活性封閉抗體可以有效防止錯配引起的非特異性擴增，提升了全預混反應體系的穩定性，然而Taq DNA聚合酶除了具有5'→3'聚合酶活性，還有5'→3'核酸外切酶活性，這部分外切酶活性可能會在低溫時導致錯配探針或其它物料降解，造成非特異信號。因此翊圣開發了雙封閉抗體，不僅可以封閉Taq DNA聚合酶的聚合酶活性，還能同時封閉Taq DNA聚合酶的外切酶活性，雙管齊下，既能有效防止錯配或引物二聚體引起的非特異性擴增，又能防止物料降解產生非特異信號，雙重提升試劑穩定性，使檢測試劑在運輸或室溫使用過程中都能夠從容應對。
圖1. 傳統抗體法封閉原理示意圖
圖中高亮部分為Taq DNA聚合酶5'→3'聚合酶活性結構域，抗體只封閉Taq DNA聚合酶的5'→3'聚合酶活性
圖2. 翊圣雙封閉抗體封閉原理示意圖
圖中高亮部分為Taq DNA聚合酶5'→3'聚合酶活性結構域和5'→3'核酸外切酶活性結構域，翊圣雙封閉抗體含兩種抗體，可同時封閉Taq DNA聚合酶的5'→3'聚合酶活性和5'→3'核酸外切酶活性
圖3. 雙封閉抗體外切酶活性封閉效率檢測
設計引物探針配于反應液中，40℃反應，檢測熒光信號。
黃色為未封閉的Taq DNA聚合酶組
紫色為雙封閉抗體封閉的Taq DNA聚合酶組
由圖3可以看出雙封閉抗體可有效封閉Taq DNA聚合酶的外切酶活性。
雙封閉抗體有效提升檢測試劑穩定性
用傳統封閉抗體與雙封閉抗體分別封閉Taq DNA聚合酶，配置成含引物探針的全預混液，在4℃或37℃放置10天或1、3、5天，擴增10000拷貝ASF基因質粒，觀察擴增曲線和CT值變化，對比傳統封閉抗體和雙封閉抗體對全預混反應液穩定性的作用。
圖4. 傳統封閉抗體封閉反應液擴增10000拷貝ASF基因質粒擴增曲線圖
藍色為含引物探針全預混液4℃放置10天后擴增曲線，紅色為4℃放置0天對照
圖5. 雙封閉抗體封閉反應液擴增10000拷貝ASF基因質粒擴增曲線圖
藍色為含引物探針全預混液4℃放置10天后擴增曲線，紅色為4℃放置0天對照
由圖4、圖5可以看出，雙封閉抗體比傳統封閉抗體更能保持反應液穩定，有效提升檢測試劑穩定性。雙封閉抗體封閉含引物探針全預混液4℃放置10天擴增曲線和CT值無明顯變化。
圖6. 傳統封閉抗體封閉反應液擴增10000拷貝ASF基因質粒擴增曲線圖
藍色為含引物探針全預混液37℃放置5天后擴增曲線
綠色為含引物探針全預混液37℃放置3天后擴增曲線
黃色為含引物探針全預混液37℃放置1天后擴增曲線
紅色為37℃放置0天對照
圖7. 雙封閉抗體封閉反應液擴增10000拷貝ASF基因質粒擴增曲線圖
藍色為含引物探針全預混液37℃放置5天后擴增曲線
綠色為含引物探針全預混液37℃放置3天后擴增曲線
黃色為含引物探針全預混液37℃放置1天后擴增曲線
紅色為37℃放置0天對照
由圖6、圖7可以看出，雙封閉抗體比傳統封閉抗體更能保持反應液穩定，有效提升檢測試劑穩定性。雙封閉抗體封閉含引物探針全預混液37℃放置1、3、5天CT值差小于0.2。
雙封閉抗體幫助解決基線上漂問題
某些引物配合特定buffer和儀器時，會出現基線上漂的情況。翊圣嘗試多種方法改善基線問題，發現雙封閉抗體更有利于基線平穩。
圖8. N基因擴增曲線圖
紅色為傳統封閉抗體封閉反應液擴增曲線
綠色為雙封閉抗體封閉反應液擴增曲線
圖9. ACT基因擴增曲線圖
紅色為傳統封閉抗體封閉反應液擴增曲線
綠色為雙封閉抗體封閉反應液擴增曲線
由圖8、圖9可以看出特定引物和buffer下，使用雙封閉抗體可幫助解決基線上漂問題。
使用雙封閉抗體獲得良好線性
用雙封閉抗體封閉的反應液擴增100000、10000、1000、100拷貝ASF/ACT雙質粒，制作標準曲線。
圖10. 雙封閉反應液制作ASF基因標準曲線圖
ASF基因標準曲線R2：0.998，擴增效率98.848%，線性良好，無非特異性擴增。
圖11. 雙封閉反應液制作ACT基因標準曲線圖
ACT基因標準曲線R2：0.998，擴增效率98.113%，線性良好，無非特異性擴增。
翊圣生物提供高品質核酸檢測試劑原料
翊圣生物十年匠心，專注于分子工具酶原料的生產和開發。翊圣生物憑借自身成熟抗體篩選平臺，以Taq DNA聚合酶為靶標分子進行封閉抗體的篩選，經過多年的潛心研究與體系優化開發出熱啟動Taq DNA聚合酶雙封閉抗體，驗證可封閉多種Taq DNA聚合酶突變體，目前已有克級現貨庫存，助力核酸檢測應用。
產品信息
產品名稱 | 產品編號 | 規格 |
Hieff® Double-Block anti-Taq DNA Polymerase Antibody | 31303ES60 | 100 µg |
Hieff® Double-Block anti-Taq DNA Polymerase Antibody | 31303ES80 | 1 mg |
Hieff® Double-Block anti-Taq DNA Polymerase Antibody | 31303ES90 | 5 mg |
Hieff® Double-Block anti-Taq DNA Polymerase Antibody | 31303ES92 | 10 mg |
Hieff® Double-Block anti-Taq DNA Polymerase Antibody | 31303ES93 | 100 mg |
Hieff® Double-Block anti-Taq DNA Polymerase Antibody | 31303ES94 | 1000 mg |
關于翊圣生物
上海翊圣生物科技有限公司（Yeasen Biotech Co., Ltd）成立于2009年，長期專注于分子酶原料及建庫試劑盒等產品的研發和生產。
我們的目標讓下游企業節省更多的成本，為中國精///準醫療的發展貢獻自己的力量。
翊圣生物擁有*分子酶雙向技術平臺、大規模蛋白發酵純化技術平臺、高效抗體篩選技術平臺，目前已成功開發各類診斷分子酶、二代測序建庫酶等40余種，并實現工業放大。翊圣生物開發的PCR類、NGS類、體外診斷（IVD）和相關酶原料等產品獲得了廣大客戶的認可。此外，我們還為工業客戶提供定制化開發服務，以滿足個性化需求。
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