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干貨分享|熱啟動酶耐熱機制全面解析
常規PCR技術因能夠快速擴增任何已知的DNA///片段而被廣泛應用于分子生物學的各個領域。但常規型PCR技術容易出現引物二聚體或錯配引起的非特異性擴增等現象，造成實驗結果的不準確性。熱啟動型PCR能夠很好的解決上述問題，是常用的提高PCR特異性的方法。
熱啟動酶介紹
熱啟動酶（Hot start enzyme）主要利用酶的修飾物在常溫下抑制DNA聚合酶的活性，加熱至變性溫度時修飾物失活，釋放酶活，從而使PCR反應得以正常進行。目前市面上常用的DNA聚合酶熱啟動修飾方法主要有化學修飾、配體修飾和抗體修飾等，不同的熱啟動修飾方法原理上有所區別，各有優劣勢。
化學法
DNA聚合酶的化學法修飾，一般采用化學小分子如酸酐等有機物與聚合酶上的側鏈氨基酸（賴氨酸）通過化學反應相互作用，使酶低溫時失去酶活，溫度升高后，酸酐與氨基之間的化學鍵斷裂，酶活釋放，從而達到熱啟動效果。化學修飾可有效封閉酶的活性，操作簡單，但酶活性釋放速度較慢，依賴溫度激活DNA聚合酶，能有效抑制非特異性產物，可在室溫下配置反應體系，且對PCR反應buffer要求較高。
圖1：化學法修飾熱啟動酶原理圖
配體法
配體法修飾，主要借助核酸適配體封閉酶活。顧名思義，核酸適配體一般指一類具有特異性識別功能的單鏈核酸分子，可以是RNA也可以是DNA，長度一般為25～60個核苷酸。作為一種寡核甘酸序列的識別分子，作用的靶分子范圍廣泛，從無機金屬的小分子到生物領域的大分子。這些適配子可以形成特定的空間構象，從而在表觀功能上與抗體類似。對蛋白質或其他小分子物質具有高度特異性、親和力。核酸適配體通過非共價鍵與DNA聚合酶結合，進而抑制聚合酶在非許可溫度下的聚合反應。一般核酸適配體的篩選所需周期較短，整個過程能夠依賴自動化，簡便快捷。
圖2：配體法修飾熱啟動酶原理圖
抗體法
抗體法熱啟動酶一般考慮使用DNA聚合酶抗體封閉酶活性，使其在低溫時處于無活性狀態，在加熱至變性溫度時抗體變性，解除封閉從而釋放活性，可以大大避免錯配或引物二聚體引起的非特異性擴增。另一方面針對低豐度基因，封閉抗體在避免預變性前的DNA聚合酶和模板的非特異性結合的同時，增加了引物與微量的正確模板碰撞退火的效率，從而保證低豐度基因的有效檢出，大大提升反應靈敏度和擴增效率。
圖3：抗體法修飾熱啟動酶原理圖
表1：熱啟動酶常見修飾方法優劣勢比較
酶活封閉類型 | 化學修飾 | 配體修飾 | 抗體修飾 |
原理 | 化學小分子和DNA聚合酶活性中心結合封閉酶活 | 核酸適配體通過非共價鍵作用與聚合酶結合封閉酶活 | DNA聚合酶抗體與聚合酶結合封閉酶活 |
酶活釋放條件 | 溫度：大于95 ℃ 時間：10-15 min | 溫度：大于60 ℃ 時間：1-5 min | 溫度：大于70 ℃ 時間：30 s-5 min |
優點 | 酶活性維持更加穩定且無任何外源DNA污染，性價比較高。 | 不需要激活步驟，穩定性高，減少樣品降解的可能性。 | 酶激活時間短，保證酶活，親和力強，靈敏度高。 |
缺點 | 酶激活時間較長可能會影響酶的活性，導致PCR產物的產量降低。 | 核酸配體是一種可逆抑制劑，不如化學修飾法穩定，特異不夠強。 | 抗體修飾是一種動態平衡，抗體生產成本高，試劑配比優化時間長。 |
以上簡單介紹了熱啟動酶的常見類別和各種熱啟動方法的優劣勢，其中化學修飾物不能夠批量合成，而且需要較長的激活時間聚合酶才能釋放酶活。配體修飾DNA聚合酶只在20-25°C效果較好，到40°C時，聚合酶的活性就被釋放出來，特異性不好；而抗體法修飾熱啟動酶對應的封閉效果佳，酶活釋放速度快，從而大大降低PCR反應時間，是目前IVD市場上應用較多的一種熱啟動酶改造方法。
熱啟動酶應用
熱啟動酶在熱啟動PCR的應用方面較為廣泛，不僅有效防止非特異性PCR產物，而且在較難擴增的PCR反應如單拷貝基因的擴增、多重PCR和超長片段的擴增等應用尤為突出，大大改觀了傳統PCR技術的局限性。在病原微生物檢測、遺傳病診斷和法醫鑒定等各個領域等實際應用中頗為廣泛。在應對爆發的新guan疫情方面，熱啟動酶亦貢獻頗多。目前市面上應用于SARS-Cov-2的一步法RT-qPCR檢測試劑的核心酶基本都是抗體法熱啟動酶。
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類型 | 名稱 | 貨號 | 規格 | 價格(元） | 優惠價（元） |
抗體法熱啟動酶 | Hieff Unicon® Hotstart J-Taq DNA polymerase | 13086ES60/76/90 | 100 U/500 U/ 5000 U | 詢價 | |
Hieff Unicon® Hotstart D-Taq DNA Polymerase | 10715ES01/03/25/60 | 100µl/1mL/25mL/ 100mL | 1652/13252/127852/887652 | / | |
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參考文獻
【1】Michael R. Green, Joseph Sambrook. Hot Start Polymerase Chain Reaction (PCR)[J]. 2018, 2018(5):pdb.prot095125.
【2】Kermekchiev, M. B . Cold-sensitive mutants of Taq DNA polymerase provide a hot start for PCR[J]. Nucleic Acids Research, 2003, 31(21):6139-6147.
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【4】劉峰濤,柴立輝,馬遠方.DNA聚合酶適配子6-10提高定量PCR的特異性[J].臨床檢驗雜志,2009,27(03):164-166.
