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精子DNA吖啶橙（acridine orange）熒光檢測試劑盒產品說明書

主要用途

精子DNA吖啶橙（acridine orange）熒光檢測試劑是一種旨在使用吖啶橙染料使單鏈和雙鏈DNA呈現不同熒光，確定精子染色質質量或DNA損傷的而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。適用于各種動物或人體精子細胞以及凍存精子細胞。產品嚴格無菌，即到即用，操作簡便，性能穩定，熒光清晰。

技術背景

在男科學（Andrology）中，精子（spermatozoa）分析提供了精子生成（spermatogenesis）、精子壽命、以及生育能力的基礎信息。其中精子的活力（vitality）、運動能力（motility）、授精潛力（fertilizing potential）、膜結構或染色質結構完整性（integrity）、頂體反應（acrosomal reaction）功能的評價是精子分析的重要指標，也是決定人工受孕或體外授精（in vitro fertilization；IVF）的重要參數。精子DNA損傷或染色質質量是不育癥的主要因素之一。使用陽離子三環胺熒光染料吖啶橙（Acridine orange；AO）染色技術，是精子染色質分析和授精效率評價的常用的方法。基于正常精子細胞的染色質完整性和DNA雙鏈特性，作為DNA染色劑之一的吖啶橙與正常非變性DNA，即雙鏈DNA嵌合（intercalate）時，呈現綠色熒光（激發波長488nm，散發波長530nm）；而與變性DNA，即單鏈DNA結合時，呈現紅色熒光（激發波長488nm，散發波長630nm），以此定量分析精子質量或DNA損傷。 

產品內容

清理液（Reagent A）                                      毫升
固著液（Reagent B）                                      毫升
染色液（Reagent C）                                      毫升
產品說明書                                                    1份

保存方式

保存清理液（Reagent A）在4℃冰箱里，其余的保存在－20℃冰箱里；染色液（Reagent C）避免光照，有效保證6月
  
用戶自備

1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器
微型臺式離心機：用于樣品操作
血細胞計數器：用于細胞計數
載玻片和蓋玻片：用于精子細胞爬片
（共聚焦）熒光顯微鏡：用于觀察染色的精子細胞
細胞流式儀：用于分析染色的精子細胞

實驗步驟

一、細胞流式儀分析

1．移取新鮮獲得的1毫升精液（30分鐘至1小時內）到1.5毫升離心管
2．放進微型臺式離心機離心5分鐘，速度為600g 
3．小心抽去上清液
4．加入xx毫升清理液（Reagent A），混勻顆粒群
5．在血細胞計數器上進行精子細胞計數：1 × 107精子細胞/毫升
6．放進微型臺式離心機離心5分鐘，速度為600g 
7．小心抽去上清液
8．重復實驗步驟4至7一次（不包括實驗步驟5）
9．加入xx微升染色液（Reagent B），混勻顆粒群
10．室溫下孵育10分鐘，避免光照
11．放進微型臺式離心機離心5分鐘，速度為600g 
12．小心抽去上清液
13．加入xx毫升清理液（Reagent A），混勻顆粒群
14．放進微型臺式離心機離心5分鐘，速度為600g 
15．小心抽去上清液
16．重復實驗步驟13至15一次
17．加入xx毫升清理液（Reagent A），混勻顆粒群
18．即刻進行細胞流式儀雙通道分析：觀察10000個細胞以上，200細胞/秒；激發波長200mW，散發波長16 mW

激發波長    488nm    488nm
匹配熒光染料    異硫氰酸熒光素（FITC）    藻紅蛋白（phycoerythrin；PE）
熒光顏色    綠色    紅色
散發波長    530    630
流式儀通道    FL1    FL3
熒光增強    正常精子DNA    異常精子DNA
19．細胞流式儀檢測正常精子DNA（雙鏈DNA）參考圖像如下（X軸：FL3；Y軸：FL1；R1左下角為細胞碎屑；R2為正常精子細胞；R3為異常精子細胞；R4為未成熟精子細胞）

二、熒光顯微鏡分析

1．移取新鮮獲得的1毫升精液（30分鐘至1小時內）到1.5毫升離心管
2．放進微型臺式離心機離心5分鐘，速度為600g 
3．小心抽去上清液
4．加入xx毫升清理液（Reagent A），混勻顆粒群
5．在血細胞計數器上進行精子細胞計數：1 × 107精子細胞/毫升
6．放進微型臺式離心機離心5分鐘，速度為600g 
7．小心抽去上清液
8．重復實驗步驟4至7一次（不包括實驗步驟5）
9．加入xx毫升清理液（Reagent A），混勻顆粒群
10．即刻移取20微升到潔凈的載玻片一端
11．用蓋玻片或另一個載玻片推片
12．置于空氣中涼干
13．加上xx微升固著液（Reagent B），覆蓋樣品表面
14．室溫下孵育2小時
15．小心抽去固著液
16．小心加上xx微升染色液（Reagent C），覆蓋樣品表面
17．室溫下孵育5分鐘，避免光照
18．小心抽去染色液
19．小心加上xx微升清理液（Reagent A），覆蓋樣品表面
20．小心抽去清理液
21．蓋上蓋玻片
22．即刻在（共聚焦）熒光顯微鏡下觀察并計數（注意：每個視野計數200個精子）
23．分析結果（參考圖）
觀察紅色熒光：濾波器激發波長488nm，散發波長630nm ――可見黃色、桔紅色至紅色熒光，表明精子
DNA損傷包括單鏈DNA

觀察綠色熒光：濾波器激發波長490nm，散發波長530nm ――可見綠色熒光，表明精子DNA正常 

注意事項

1．本產品為50次操作
2．操作時須戴手套
3．樣品檢測前，建議在血細胞計數器上進行精子細胞計數
4．精子細胞計數時乘上稀釋倍數104。標準血細胞計數器（Hemocytometer）的計算方法是：
1毫米方塊的細胞計數X 104（稀釋倍數）＝實際細胞數/毫升
5．染色完成后，即刻進行檢測分析，否則由于其毒性導致精子DNA異常
6．如果流式細胞儀出現干擾，建議使用630nm散發波長，或進行補償處理，建議使用誘導處理樣品：10單位DNase I/毫升37℃孵育10分鐘或直接70℃孵育30分鐘
7．本產品常用于凍存精子細胞的檢測分析
8．本產品可以用于精子染色質結構分析（Sperm Chromatin Structure Assay；SCSA），分析參數如下：

    %DFI    %HDS
名詞解釋    DNA斷裂指數
DNA Fragmentation Index    DNA著色程度
High DNA Stainability
相同命名    COMP αt    HIGRN
計算方法    紅色熒光：紅色＋綠色熒光之比    高亮綠色熒光
參考值    正常人：小于15％    正常人：小于10％
    閾值：小于30％    閾值：小于15％
    高生育力：0－15％    
    中等生育力：16－27％    
    低或差生育力：27－30％    
參數意義    DNA損傷程度    精子成熟程度

9．本公司提供系列發育生物學相關檢測試劑產品
 
質量標準

1．本產品經鑒定性能穩定
2．本產品經鑒定熒光清晰