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精子活力和頂體反應三色（triple staining）染色試劑盒產品說明書（中文版）
主要用途
精子活力和頂體反應三色（triple staining）染色試劑是一種旨在使用臺盼藍、孟加拉紅和俾斯麥棕Y三種染料特異性著色死亡精子、完整頂體以及頂體后區，產生藍、紅棕色，從而確定細胞活力以及精子功能（頂體反應）的而經典的技術方法。該技術由大師級科學家精心研制、成功實驗證明的。適用于各種動物或人體精子細胞。產品嚴格無菌，即到即用，操作簡便，性能穩定，著色清晰。
技術背景
在學（Andrology）中，精子（spermatozoa）分析提供了精子生成（spermatogenesis）、精子壽命、以及生育能力的基礎信息。其中精子的活力（vitality）、運動能力（motility）、授精潛力（fertilizing potential）、膜結構完整性（integrity）、頂體反應（acrosomal reaction）功能的評價是精子分析的重要指標，也是決定人工受孕或體外授精（in vitro fertilization；IVF）的重要參數。其中頂體反應，是指當精子接近卵子實施授精時，精子頭部前半端的帽狀結構頂體，釋放出溶解酶，以便精子和卵子的膜融合。頂體反應測試是一項穩定的精子功能參數，可以用于預測受精成功率。因此頂體的結構完整性（intact）是評價的主要標志，也是不育癥和藥物研究的對象。三色（triple staining）染色首先使用臺盼藍（trypan blue）染色，分析精子活力，基于臺盼藍受到活體精子細胞（包括游動性和非游動性精子）的排斥，而死亡精子細胞攝入染料顯示紅色的原理。其次使用孟加拉紅或虎紅（Rose Bengal）染料與頂體內含物的結合，區別完整性（未反應性unreacted）頂體，以及俾斯麥棕Y（Bismark Brown Y）染料識別頂體后區（post-acrosomal region）染色。通過常用的一般光學顯微鏡（無需相差顯微鏡；phase-contrast microscope）便可清晰觀察到頂體缺失狀態。
產品內容
一染液（Reagent A） 毫升
清理液（Reagent B） 毫升
固定液（Reagent C） 毫升
二染液（Reagent D） 毫升
三染液（Reagent E） 毫升
產品說明書 1份
保存方式
保存在4℃冰箱里，避光，有效保證6月
用戶自備
1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器
恒溫水槽或培養箱：用于孵育反應
微型臺式離心機：用于樣品操作
血細胞計數器：用于細胞計數 1
蓋玻片：用于精子細胞爬片
一般光學顯微鏡：用于觀察染色的精子細胞
實驗步驟
1． 移取新鮮獲得的精液（30分鐘至1小時內）到1.5毫升離心管
2． 放進37℃恒溫水槽孵育30分鐘
3． 輕柔渦旋震蕩5秒
4． 移取xx微升上述精液到新的1.5毫升離心管
5． 加入xx微升一染液（Reagent A）
6． 用200微升槍頭上下抽吸混勻
7． 放進37℃恒溫水槽孵育15分鐘
8． 即刻移取xx微升到潔凈的載玻片
9． 蓋上蓋玻片
10．即刻在一般光學顯微鏡下（1000倍；即油鏡下）觀察并計數（注意：每個視野計數200個精子）
藍色染色的精子細胞為死亡細胞，而不染色的精子細胞為活體細胞
11．將1.5毫升離心管放進微型臺式離心機離心10分鐘，速度為600g（或2500RPM，例如EPPENDORF 5415）
12．小心抽掉上清液
13．加入xx微升清理液（Reagent B），混勻
14．放進微型臺式離心機離心10分鐘，速度為600g（或2500RPM，例如EPPENDORF 5415）
15．小心抽掉上清液
16．加入xx微升固定液（Reagent C），混勻
17．室溫下孵育60分鐘
18．放進微型臺式離心機離心10分鐘，速度為600g（或2500RPM，例如EPPENDORF 5415）
19．小心抽掉上清液
20．加入xx微升清理液（Reagent B），混勻
21．即刻移取12微升到潔凈的載玻片一端
22．用蓋玻片或另一個載玻片推片
23．置于空氣中涼干
24．小心加上xx微升二染液（Reagent D）在載玻片上，覆蓋樣品表面
25．放進40℃恒溫培養箱孵育5分鐘
26．即刻移去二染液（Reagent D）
27．小心加上xx微升清理液（Reagent B）在載玻片上，覆蓋樣品表面
28．即刻移去清理液（Reagent B）
29．小心加上xx微升三染液（Reagent E）在載玻片上，覆蓋樣品表面
30．室溫下孵育30分鐘
31．即刻移去三染液（Reagent E）
32．小心加上xx微升清理液（Reagent B）在載玻片上，覆蓋樣品表面
33．即刻移去清理液（Reagent B）
34．封片
35．即刻在一般光學顯微鏡下（1000倍；即油鏡下）觀察并計數（注意：每個視野計數200個精子）
粉紅色頂體和淺棕色頂體后區――活體精子未反應完整頂體
無色頂體和淺棕色頂體后區――反應后頂體（或頂體缺失）――陽性頂體反應
藍色精子細胞、粉紅色頂體和淺棕色頂體后區――死亡精子未反應完整頂體
無色頂體和無色頂體后區――死亡或凍存后、損傷后精子退化頂體（或頂體缺失）
注意事項
1． 本產品為50次操作
2． 操作時須戴手套
3． 樣品檢測前，建議在血細胞計數器上進行精子細胞計數，同時觀察精子游動
4． 精子細胞計數時乘上稀釋倍數104。標準血細胞計數器（Hemocytometer）的計算方法是：
1毫米方塊的細胞計數X 104（稀釋倍數）＝實際細胞數/毫升
5． 避免一染液（Reagent A）染色時間超過15分鐘，否則由于其毒性導致精子細胞死亡
6． 本產品可用于染色稀釋過的或凍存過的精子細胞
7． 本公司提供系列發育生物學相關檢測試劑產品
質量標準
1． 本產品經鑒定性能穩定
2． 本產品經鑒定著色清晰