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實驗動物技術:大鼠胰腺移植模型制作

2014-10-21  閱讀(1952)

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胰腺移植是目前臨床上有效治療I型糖尿病,挽救II型糖尿病晚期伴腎功能不全的外科手段,因此,胰腺移植一直受到廣泛的關注,至今圍繞著胰腺移植,仍有許多問題需要解決,這些問題的基礎研究都需要在合適的動物模型上進行,其中大鼠因為其成本低,來源易,免疫系統與人類相似等優點,是目前器官移植領域流行的實驗動物之一。但是大鼠胰腺移植模型的建立是一個難度很大的實驗外科技術,操作復雜,成功率低。因此,需要建立一種比較規范,操作簡便,模型穩定且成功率高的胰腺移植模型的方法,以利于進行胰腺移植的基礎研究。

一、  手術器械

顯微外科手術器械包,手術顯微鏡1臺,自制S拉鉤(用橡皮筋一端帶上彎成S形的大頭針)4個,眼科剪1把,其它外科器械若干及紗布、棉球、棉片和橡皮條等。

二、  供、受者大鼠的選擇

根據不同的研究目的選擇不同的動物品系,在同種移植模型中,一般采用兩種純系健康大鼠,如Lewis大鼠,Brown Norway 大鼠(BN),DA大鼠等,國內應用Wistar,SD大鼠也比較多。其中受者大鼠于移植手術前制備成糖尿病模型

三、大鼠糖尿病模型的建立

方法一:10%的四氧嘧啶按100mg/kg的劑量連續兩天于大鼠腹股溝區皮下注射,隔日測定血糖,一周后血糖持續>16.7mmol/L者,作為合格的糖尿病受者大鼠。

方法二:采用70mg/kg肌肉注射鏈脲霉素,以尿糖定性強陽性,非禁食血糖>20mmol/L持續10天者為穩定的糖尿病模型。

方法三:受者鼠一次性靜脈注射鏈脲霉素55mg/kg,第7d開始測定非禁食血糖,若血糖濃度連續3d超過22mmol/L,判定為大鼠糖尿病誘導成功。

四、術前準備及麻醉方式

術前供者禁食24h,飲用50g/L葡萄糖生理鹽水,受者禁食24h,飲用25g/L葡萄糖生理鹽水,供、受者麻醉均采用1%的戊巴比妥鈉40mg/kg腹腔注射,麻醉過淺時加吸入輔助。

五、供胰切取術

麻醉成功后,經腹正中切口進腹,(1)將胃向上翻起,結扎切斷胰腺和大網膜之間的血管及胃網膜左右動靜脈,結扎十二指腸近端,切斷幽門,在食管與胃交界出結扎切斷胃左血管、食管,結扎切斷胃短動脈并切除全胃;(2)胰腺下緣自脾臟向胰頭方向游離胰腺,保留胰管入十二指腸管約1.5cm,結扎切斷腸系膜上血管;(3)結扎切斷膽總管及肝固有動脈,游離門靜脈至入肝門分叉處;(4)打開腹主動脈前被覆的后腹膜,結扎切斷左右腎及腎上腺動脈,*游離腹腔動脈和腸系膜上動脈所在的腹主動脈段,經陰莖背靜脈注入肝素(25U/L)生理鹽水;(5)分別結扎腸系膜上動脈開口以下和腹腔動脈開口以上的腹主動脈,腸系膜上動脈開口以下腹主動脈插管,予以4℃ Euro Collins液(或者4℃平衡液25U/L肝素溶液)灌洗移植物,同時橫斷門靜脈,灌洗至門靜脈斷端流出液轉清,移植物顏色由淡紅變為蒼白;(6)灌洗完成后,完整地切取移植物及脾臟,移植物置4℃Euro Collins液中保存。

六、供胰植入術

(一) 腔靜脈-膀胱引流式胰腺移植

下腹正中切口進腹,用生理鹽水紗布將腸管推向上方,膀胱、精囊腺推向下方并以拉鉤固定,游離髂血管分叉上方1.5cm左右的腹主動脈及下腔靜脈,經陰莖背靜脈注射肝素(25IU/L)至全身肝素化,血管夾阻斷游離血管上下端,9-0無創顯微縫線作供者門靜脈與受者下腔靜脈連續端-側吻合,8-0無創顯微縫線作供者腹主動脈與受者腹主動脈連續端-側吻合。吻合過程中移動胰腺時,牽動與移植胰腺相連脾臟,避免直接鉗夾移植胰。吻合口及供者腹主動脈表面可以涂少量的ZT膠,以封閉吻合口縫隙和腹主動脈營養血管,切除移植物附帶的脾臟,先遠心端再近心端松開血管夾,恢復移植胰血供。

將供者十二指腸段與受者膀胱頂部行側-側吻合(3-0絲線單層連續縫合),吻合口大約0.5cm,大網膜覆蓋移植物,關腹結束手術。

(二)門靜脈-腸道引流式胰腺移植

腹正中切口入腹,打開腹腔,在左腎靜脈以下,分離出腹主動脈,用改良過的李氏鉗縱行夾住該段動脈,縱行切開動脈閉,用含肝素的平衡鹽溶液沖洗管腔,在低位分離腸系膜上靜脈,近端用微血管夾夾住,遠端用3-0絲線結扎,在同一水平高度同時結扎腸系膜上動脈。緊靠絲線結扎處切斷腸系膜上靜脈,管腔同樣用含肝素的平衡鹽溶液沖洗,切斷缺血的小腸及回盲部(30~40%),用7-0尼龍線將兩斷端行端-端全層腸吻合,將移植物從冰水中移出,用帶冰屑的濕紗布覆蓋移植物。先行靜脈縫合,應確保靜脈吻合后無扭轉,供者門靜脈與受者腸系膜上靜脈以10-0無損傷顯微縫線端-端間斷縫合,在縫合過程中,用生理鹽水灌洗靜脈腔,并輕輕地用顯微鉗分離血管邊緣,避免吻合口狹窄。供胰腺的腹主動脈與受者的腹主動脈以9-0無損傷顯微縫合線行端-側連續縫合。吻合完畢后先松開靜脈夾,再松開動脈夾,用干明膠海綿輕壓動脈吻合口1~2min。zui后,供胰的十二指腸開口一端與受者近端空腸行端-側吻合,另一端結扎。切除供胰上附著的脾臟,關腹結束手術。

七、術后監測和處理

根據實驗研究設計的需要監測移植胰功能,如果移植胰功能正常,在發生排斥反應以前空腹血糖值正常,C-肽值正常。

術后注意受者動物保溫,可以置于電熱毯上,以電燈熱輻射24h。一般情況下,動物于術后1h內從麻醉中蘇醒。術后每天皮下注射含25g/L葡萄糖和4.5g/L氯化鈉的糖鹽水30~40ml(內含150mg氧哌嗪青霉素),36~48h視動物情況開始正常飲食。

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