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【感受態(tài)細(xì)胞的制備】 一步法制備感受態(tài)細(xì)胞

2013-5-15　　閱讀(1452)

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一、操作步驟：

1. 涂平板：為取得*的感受態(tài)效率，必須先把甘油菌或其它形式保存的菌種涂LB平板，并培養(yǎng)過夜。

2. 接種：取一有新鮮培養(yǎng)的菌種的LB平板，后續(xù)操作均在超凈臺內(nèi)進(jìn)行。把鑷子的頂端在70%酒精中蘸一下，并在酒精燈上略略燒一下，使鑷子的頂端處于無菌狀態(tài)。用鑷子夾取一個(gè)無菌的塑料槍頭或牙簽，從平板上挑取一個(gè)單克隆，然后把蘸有菌種的塑料槍頭或牙簽放到裝有3毫升LB的細(xì)菌培養(yǎng)試管內(nèi)。上述操作也可以使用接種環(huán)等進(jìn)行操作。

3. 培養(yǎng)：37℃約200rpm培養(yǎng)過夜，通常培養(yǎng)時(shí)間控制在16小時(shí)左右為宜。不宜超過18小時(shí)。

4. 再接種培養(yǎng)：根據(jù)需要制備的感受態(tài)細(xì)菌的量，按照1:100的比例用新鮮培養(yǎng)的過夜菌接種培養(yǎng)。例如取500微升的新鮮過夜菌到50毫升的LB中繼續(xù)37℃約200rpm培養(yǎng)。通常在大約培養(yǎng)2-2.5小時(shí)后OD600可以達(dá)到0.3-0.5。

5. 制備感受態(tài)細(xì)菌：在培養(yǎng)的細(xì)菌OD600達(dá)到0.3-0.5時(shí)，4℃2000g離心5分鐘收集細(xì)菌。如果離心沉淀前的菌量為50毫升，按后續(xù)操作進(jìn)行，如果是其它體積則按比例換算后進(jìn)行后續(xù)操作。用5毫升預(yù)冷的LB重新懸浮起細(xì)菌沉淀，加入5毫升在冰浴或冰水浴上融解的感受態(tài)制備試劑，混勻，冰浴放置5分鐘。然后再輕輕混勻，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要適當(dāng)分裝到1.5毫升或0.5毫升的離心管內(nèi)后-70℃保存。

注：如果以后會只做單管的轉(zhuǎn)化，可以分裝成每管zui少50微升或100微升，如果以后一次性做多個(gè)轉(zhuǎn)化，可以每管分裝500微升或更大體積。-70℃保存后，感受態(tài)的效率會隨時(shí)間的推移逐漸下降，但通常在半年內(nèi)使用轉(zhuǎn)化效率下降不會太多。總的來說，新鮮制備的感受態(tài)要比凍存的感受態(tài)轉(zhuǎn)化效率更高一些。

二、注意事項(xiàng)：

1. 需自行配制LB液體培養(yǎng)基和LB平板以用于細(xì)菌的培養(yǎng)和感受態(tài)效率的檢測。

2. 盡管凡是處于對數(shù)期內(nèi)的細(xì)菌都可以用于感受態(tài)細(xì)菌的制備，但如果細(xì)菌生長的OD600的值達(dá)到0.3-0.5左右時(shí)，制備出來的感受態(tài)效果*。

3. 在制備感受態(tài)細(xì)菌的過程中均使用不含抗生素的LB。在使用感受態(tài)菌的過程中熱休克后的37℃培養(yǎng)時(shí)也必須使用無抗生素的LB，即便轉(zhuǎn)入的質(zhì)粒是有抗性的。

4. 為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

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