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士鋒生物細胞周期測定的方法步驟
點擊次數：601 發布時間：2014-2-21
<img alt="細胞周期測定的方法步驟" 細胞周期測定的方法步驟"="" border="1" height="355" data-cke-saved-src="http://www.bio1000.com/uploads/allimg/120928/0923303359-0.jpg" src="http://www.bio1000.com/uploads/allimg/120928/0923303359-0.jpg" width="355" style="vertical-align: middle; border: 0px; width: 285px; height: 274px;">
一、原理
細胞周期指細胞一個世代所經歷的時間。從一次細胞分裂結束到下一次分裂結束為一個周期。細胞周期反應了細胞增殖速度。
單個細胞的周期測定可采用縮時攝影的方法，但它不能代表細胞群體的周期，故現多采用其他方法測群體周期。
測定細胞周期的方法很多，有同位素標記法、細胞計數法等，這里介紹一種利用BrdU滲入測定細胞周期的方法。
BrdU (5-溴脫氧尿嘧啶核苷)加入培養基后，可做為細胞DNA復制的原料，經過兩個細胞周期后，細胞中兩條單鏈均含BrdU的DNA將占l/2，反映在染色體上應表現為一條單體淺染。如經歷了三個周期，則染色體中約一半為兩條單體均淺染，另一半為一深一淺。細胞如果僅經歷了一個周期，則兩條單體均深染。計分裂相中各期比例，就可算出細胞周期的值。
二、儀器、用品與試劑
1、儀器、用品：同常規細胞培養
2、試劑：BrdU(1.0mg/ml)，甲醇、冰醋酸，Giemsa染液，秋水仙素，2×SSC液
三、操作步驟
1、細胞生長至指數期時，向培養液中加入BrdU，使zui終濃度為10μg/ml。
2、44小時加秋水仙素，使每毫升中含0.1μg。
3、48小時后常規消化細胞至離心管中，注意培養上清的漂浮細胞也要收集到離心管中。
4、常規染色體制片。
5、染色體玻片置56℃水浴鍋蓋上，鋪上2×SSC 液，距紫外燈管6cm處紫外照射30分鐘。
6、棄去2×SSC液，流水沖洗。
7、Giemsa液染色10分鐘，流水沖洗，晾干。
8、鏡檢100個分裂相，計*、二、三、四細胞期分裂指數。
9、計算：
細胞周期(Tc)=48/{(M1+2M2+3M3 +4M4)/100}(小時)
附：(1)BrdU配制: BrdU 10mg十雙蒸水10ml 4℃下避光保存。
(2)2×SSC配制: NaCl 1.75克，檸檬酸三鈉•2H2O 0.88克，加水至100ml，4℃保存。