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實驗中Western blot中NC膜和PVDF膜的選擇及其特點
點擊次數：1579 發布時間：2014-1-20
western blot中膜的選擇是實驗成功的關鍵點，Western blot實驗中一般可以選擇硝酸纖維素膜(NC) 和PVDF膜，那NC膜和PVDF膜有什么區別呢？怎樣才能選擇zui恰當的雜交膜進行Western blot實驗呢？
NC膜 PVDF膜 尼龍膜的特點
解答：尼龍膜是較理想的核酸固相支持物，有多種類型;硝酸纖維素膜(NC膜)是目前應用zui廣的一種固相支持物，價格*;PVDF膜介于二者之間。
就結合能力而言：尼龍膜結合DNA和rna能力可達480-600μg/cm2，可結合短至10bp的核酸片段;硝酸纖維素膜(NC膜)結合DNA和RNA能力可達80-100μg/cm2，對于200bp的核酸片段結合能力不強;PVDF膜結合DNA和RNA能力可達125-300μg/cm2。
就溫度適應性而言：尼龍膜經烘烤或紫外線照射后，核酸中的部分嘧啶堿基可與膜上的正電荷結合;硝酸纖維素膜(NC膜)依靠疏水性相互作用結合DNA，結合不牢固;PVDF膜結合牢固，耐高溫，特別適合于蛋白印跡。
就韌性而言：尼龍膜較強;硝酸纖維素膜較脆，易破碎;PVDF膜較強。
就重復性而言：尼龍膜可反復用于分子雜交，雜交后，探針分子可經堿變性被洗脫下來;硝酸纖維素膜(NC膜)不能重復使用;PVDF膜可以重復使用。
Western blot時該選擇NC膜還是PVDF膜?
硝酸纖維素膜：硝酸纖維素膜（NC膜）是蛋白印跡實驗的標準固相支持物。在低離子轉移緩沖 液的環境下，大多數帶負電荷的蛋白質會與硝酸纖維素膜發生疏水作用而高親和力的結合在一起，雖然這其中的機制還不是十分清楚，但由于硝酸纖維素膜（NC膜）的這個特性，而且易于封閉非特異性結合，從而得到了廣泛的應用。在非離子型的去污劑作用下，結合的蛋白還可以被洗脫下來。根據被轉移的蛋白分子量大小，要選擇不同 孔徑的硝酸纖維素膜（NC膜）。因為隨著膜孔徑的不斷減小，膜對低分子量蛋白的結合就越牢固。但是膜孔徑如果小于0.1mm，蛋白的轉移就很難進行了。因此，我們通 常用0.45μm和0.2μm兩種規格的硝酸纖維素膜。大于20kD的蛋白就可以用0.45μm的膜，小于20kD的蛋白就要用0.2μm的膜了，如果用 0.45μm的膜就會發生“Blowthrough”的現象。從膜的質地上來看，zui重要的指標就是單位面積上能夠結合的蛋白的量。硝酸纖維素膜（NC膜）的結合能力主要與膜的硝酸纖維素的純度有關，市場上有些硝酸纖維素膜（NC膜）通常會還有大量的醋酸纖維素，因而降低了蛋白的結合量。如果采用的是100%純度的硝酸纖維素， 保證了zui大的蛋白結合量，可達80-150μg/cm2。由于100%的純度，因而也大大減少了非特異性的結合，降低雜交背景，無 需高嚴謹度的洗脫步驟。其次，膜的強度和韌性也是需要考慮的因素。常規的硝酸纖維素膜比較脆，漂洗一兩次就會破損，不能反復使用。
PVDF轉移膜：PVDF是一種高強度、耐腐蝕的物質，通常是用來制造水管的。 PVDF膜可以結合蛋白質，而且可以分離小片段的蛋白質，zui初是將它用于蛋白質的序列測定，因為硝酸纖維素膜在Edman試劑中會降解，所以就尋找了 PDVF作為替代品，雖然PDVF膜結合蛋白的效率沒有硝酸纖維素膜高，但由于它的穩定、耐腐蝕使它成為蛋白測序理想的用品，一直沿用至今。PVDF膜與 硝酸纖維素膜一樣，可以進行各種染色和化學發光檢測，也有很廣的適用范圍。這種PVDF膜，靈敏度、分辨率和蛋白親和力在精細工藝下比常規的膜都要高，非 常適合于低分子量蛋白的檢測。但PVDF膜在使用之前必需用純甲醇進行浸泡飽和1-5秒鐘。
使用PVDF膜時，一定要先用無水甲醇預處理，再在transfer buffer中平衡好才可以使 用(PVDF膜用甲醇泡的目的是為了活化PVDF膜上面的正電基團，使它更容易跟帶負電的蛋白質結合)。經過預處理的PVDF膜在轉膜時， 可以使用不含甲醇的transfer buffer。而使用NC膜時，有的需要用無水甲醇處理，有的則不必，直接用transfer buffer平衡好就可以了。
小結：綜上所述，可以根據NC膜和PVDF膜的特點，以及實驗的目的去選擇雜交膜，例如使用PVDF膜之前一定要經過甲醇處理，當抗原抗體識別識別需要維持其三級結構時，則選擇NC膜。