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士鋒生物EAC玫瑰花環(huán)試驗
點擊次數(shù)：777 發(fā)布時間：2013-12-26
原理
b淋巴細胞表面具有補體C3受體，紅細胞可與相應(yīng)的抗體（溶血素）結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物（EA），以紅細胞作為指示細胞，通過補體傳統(tǒng)途徑活化補體，而產(chǎn)生活化的C3，然后與活化的C3結(jié)合形成花環(huán)，以供計數(shù)B淋巴細胞。
材料與試劑
1．雞紅細胞懸液的制備 由于綿羊紅細胞易與T淋巴細胞形成E—玫瑰花環(huán)，易造成混淆，所以一般在檢測B淋巴細胞時，采用雞紅細胞。從雞翼下靜脈采血，用肝素抗凝，以Hank’s洗滌2次備用。
2．抗雞紅細胞抗體的制備 選2kg～3kg的健康家兔，以Hank’s液洗過的壓積紅細胞進行免疫，每日背部皮下注射1次，共注5次，注射量為0.5 ml、1.0 ml、1.5 ml、2.0 ml、2.5ml。第六次改用靜脈注射50％壓積紅細胞懸液1ml，一日一次，連注3天。末次注射后7天試血，測定紅細胞的凝集效價，以出現(xiàn)“ "的zui高抗血清稀釋度判定為血凝效價。效價達1：2 000以上者為合格。應(yīng)用時采用凝集價的1／2（亞凝集價）作為抗血清的稀釋度（即1：4 000）。
溶血素的效價測定
試驗組
對照組
管號
1
2
3
4
5
6
7
8
溶血素稀釋倍數(shù)
10
102
103
2×103
3×103
4×103
5×103
1 ％紅細胞量（ml）
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
溶血素量（ml）
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
0.9％鹽水（ml）
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
混勻，37℃感作1h
結(jié)果判定
-
-
-
-
3．補體 當日采集豚鼠混合血清，用Hank’s液稀釋成1︰100，置4℃保存?zhèn)溆谩?br>4．無Ca2 、Mg2 pH7.2的Hank’s液
5．姬姆薩染液
6．1％戊二醛溶液
操作方法
1．分離淋巴細胞，制成約2.5×106個／ml懸液。
2．EAC懸液的制備 取4％雞紅細胞2ml于試管中，加入1︰4 000的雞溶血素2ml，混勻，置37℃水浴15min，取出后離心，用Hank’s液洗滌2次，再用Hank’s液恢復(fù)至4％紅細胞2ml，加入等量的1︰100稀釋補體，混勻，再放置37℃水浴15min取出，用Hank’s液洗滌2次，配成4％EAC細胞懸液。
3．取淋巴細胞懸液0.2ml，加入4％EAC細胞懸液0.2ml，混勻，室溫或20℃作用30min。1 000r/min離心5min，吸棄過多的上清液，放入4℃2h～4h。
4．取出后，將沉淀輕輕搖起，加1％戊二醛0.1ml，混勻后置4℃固定30min。
5．以懸液制片，自然干燥，滴加姬姆薩液染2min，加自來水繼續(xù)放置15min，沖洗，將玻片置95％酒精缸脫色15sec~30sec（以脫成淺紫藍色為度），再置鹽酸液缸（按1％HCl 1份與自來水2份）脫色（呈淡蘭略帶紅色為度）10sec左右，取出沖洗，干后鏡檢。
結(jié)果判定
凡一個淋巴細胞結(jié)合3個以上雞紅細胞即為EAC花環(huán)形成陽性細胞。共計數(shù)200個淋巴細胞，計算花環(huán)形成率。
注意事項
1．加入淋巴細胞與雞紅細胞的比例一般以1︰40為宜（1︰30～1︰50），淋巴細胞過少，花環(huán)形成率明顯減少。
2．淋巴細胞、紅細胞、補體均應(yīng)新鮮，否則花環(huán)形成率明顯下降。
3．據(jù)認為小鼠補體比豚鼠補體更為好，小鼠血清中膠固素活化因子（KAF）含量較多，可使大部分C3裂解而不易引起溶血