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士鋒生物RNA\siRNA\Oligo轉染注意事項
點擊次數：854 發布時間：2013-11-11
不同的實驗技術都是為了滿足不同的實驗需要，RNA轉染提供了另一種有別于DNA轉染的研究探索手段——直接將體外翻譯的RNA、或者病毒RNA、或RNA oligos，或siRNA、甚至核糖體利用轉染技術帶入細胞中。由于不需要經過轉錄即可直接翻譯，RNA轉染得到的結果比DNA轉染更快更直接，當然于瞬時表達。RNA轉染的這些特性很適合某些研究：比如處于非分裂期的細胞轉染或者很難用質粒轉染的細胞，RNA病毒的研究，反義RNA的轉染，sirna轉染（RNA干擾）等等。
哪些因素影響rna轉染的效率?
既然都是核酸，傳統的DNA轉染方法都可以用來轉染RNA，不過zui頭疼的就是RNA容易降解和防止RNAse污染。
RNA操作要注意的事項我們就不用羅嗦了，轉染中要額外注意的就是轉染試劑應該是確認無RNase污染的，而且也盡量避免和質粒dna轉染混用——即使試劑本身兼容DNA和RNA轉染，你也要想到人家做質粒DNA轉染時往往不會這么小心，難免將污染混入，那你豈不是很冤?多數情況下轉染試劑都不建議自己分裝，因為不同的管材可能會影響轉染試劑的穩定性，那就更得不償失了。所以RNA的轉染試劑會更好一些。還有重要的一點就是要采用無RNAse污染的血清。
轉染時的細胞匯合度常常會比DNA轉染高一點，也許是因為RNA轉染表達比DNA快?RNA轉染的用量必須參考轉染試劑說明，因為RNA和轉染試劑的比例決定了轉染復合物的結構和凈電荷，以及是否容易被細胞膜吸附和內吞。RNA少了固然表達不好，太多也會有毒性的問題。有的品牌轉染試劑有促核酸凝聚的試劑，幫助核酸折疊為較為致密的結構。如果轉染試劑對細胞沒有太大影響，轉染復合物和細胞共同孵育的時間越長當然越好。不過，如果RNA本身帶有熒光標記的化，檢測前通常要洗掉多余的RNA以免干擾結果。
除了操作，RNA本身的結構也對轉染有一定的影響。哺乳動物的mRNA分子帶有5'端帽子結構和3'端PolyA尾巴，此外還有成為IRES（internal ribosomal entry site）的核糖體結合區，這些結構或者有助于提高mRNA的穩定性，或者有助于核糖體結合到mRNA上進行翻譯。對于體外轉錄得到RNA可以通過實驗加入模擬RNA5'端帽子結構類似物而獲得這個保護性的“帽子”（Ambion公司有提供的），3'端PolyA尾巴也可以通過實驗添加。多數情況下添加這些元件有助于提高RNA進入細胞后的穩定性。但是有時候IRES元件促進翻譯的進行，而到有的細胞株中，由于缺乏相應的結合蛋白，IRES反而影響轉錄。這個在RNA轉染實驗設計中是要格外注意的。RNA干擾實驗中的sirna結構對基因沉默效果也有影響，比如推薦添加的AA（N19）TT結構（AA（N21）或者CA（N21）也是可以的）。這就不在轉染的討論范圍內了。
Oligo轉染
反義寡核苷酸一度曾經是制藥領域的希望之光。Oligo的轉染還是屬于DNA轉染，由于分子小，轉染的主要問題是轉染后的穩定性。2'-O-methyl oligoribonucleotides比一般的Oligo穩定，硫代S-Oligo可以抗拒核酸酶的降解但不可以磷酸化，如何選擇就要根據實驗目的而定了。
我們終于結束了轉染這一部分。希望對你有所幫助。zui后我們再順帶介紹通常在轉染時遇到問題該如何面對——畢竟不同的細胞和不同的實驗目的，遇到困難往往是難于預料的，所以無論前人是否已經為你提供了現成的方法，如果是除初次嘗試某種試劑或者某種細胞系，這幾個對照是一定要做的：空白對照，只加一定量核酸的對照，只加一定量轉染試劑的對照，2個以上不同的量比實驗，對于檢查問題是非常有用的。
轉染效率低：可能的原因：
轉染試劑不適合（比如空白對照的細胞存活率就低等等）
轉染試劑和核酸或者蛋白的量不夠，或者比例不對（自行調整咯，別告訴我你不會）
基因表達時間（檢測時間）有問題（孵育更長時間吧，如果沒有毒性問題的化，如果毒性也隨轉染效率提高，那就要縮小孵育時間拉）
副作用（比如目的基因的毒性）（換誘導型啟動子吧）
核酸或者蛋白質量問題（重做純化實驗）
報告基因或者檢測系統的問題
細胞死亡率高：
過量的轉染試劑或者轉染復合物（減少用量或者減少孵育時間，轉染后洗細胞）
細胞問題（重新復蘇活化一個細胞株，或者重新傳代）
目的基因毒性（減少用量）
轉染效率重復性差：
細胞匯合度不同（保證同樣的接種量同樣的時間）
支原體污染（殺了它吧，重新復蘇一管新的）
細胞傳代次數太高了（重新復蘇一管新的細胞）
血清質量不穩定（一次囤積同一批號的血清吧）