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士鋒生物斐林試劑比色法測定還原糖
點擊次數(shù)：740 發(fā)布時間：2013-9-22
一、原理
植物組織中的可溶性糖可分為還原糖（主要是葡萄糖和果糖）和非還原糖（主要是蔗糖）兩類。還原糖具有醛基和酮基，在堿性溶液中煮沸，能把斐林試劑中的Cu2+還原成Cu+，使藍(lán)色的斐林試劑脫色，脫色的程度與溶液中含糖量成正比。
二、材料、儀器設(shè)備及試劑
（一）材料：新鮮植物樣品或烘干粉碎過的植物樣品。
（二）儀器設(shè)備：1. 分光光度計；2. 分析天平（感量1／10000）；3. 水浴鍋；4. 具塞刻度試管；5. 刻度吸管；6. 容量瓶；7. 研缽；8. 離心機。（三）試劑：1. 斐林試劑A液：40gCuSO4.5H2O溶解于蒸餾水定容至1L。
2. 斐林試劑B液：200g酒石酸鉀鈉（KNaC4H4O6.5H2O）與150g NaOH溶于蒸餾水中，并定容至1升。A、B兩液分別貯存，使用前等體積混合。
3. 0.1％葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液：取80℃下烘至恒重的葡萄糖0.1000g，加蒸餾水溶解，定容至100ml。
4. 0.1NNaOH。
5. 甲基紅指示劑：0.1g甲基紅溶于250ml 60％乙醇中。
6. 10％Pb（Ac）2。
7.飽和Na2SO4。
三、實驗步驟
1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制：各管混合后加塞，于沸水浴中加熱15min。取出后自來水冷卻，1500rpm離心15min。取上清液，用分光光度計在590nm波長下比色，以蒸餾水作對照，讀取吸光度用空白管的吸光度與不同濃度糖的各管的吸光度之差為橫坐標(biāo)，對應(yīng)的糖含量為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
2. 樣品中還原糖的提取：取新鮮的植物樣品洗凈、擦干、剪碎，稱取10.00g，放入研缽中研磨至糊狀，用水洗入250ml容量瓶中。當(dāng)體積近150ml左右時，加2～3滴甲基紅指示劑，如呈紅色，可用0.1mol/L 的NaOH中和至微黃色。若用風(fēng)干樣品，可稱取干粉3.00g，先在燒杯中用少量水濕潤，然后用水洗入250ml容量瓶中，如顯酸性，可用上法中和。將容量瓶置于80℃的恒溫水浴中保溫30min，其間搖動數(shù)次，以便將還原糖充分提取出來。對含蛋白質(zhì)較多的樣品，此間可加10％Pb（Ac）2，除去蛋白質(zhì)，至不再產(chǎn)生白色絮狀沉淀時，加飽和Na2SO4除去多余的鉛離子。30min后取出冷卻，定容至刻度，搖勻后過濾待測。
3. 樣品測定：吸取6ml待測液，加4ml斐林試劑，其它操作與標(biāo)準(zhǔn)曲線相同，在590nm波長下讀取吸光度。以不含樣品的空白管的吸光度減去樣品管的吸光度，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出糖含量.
四、結(jié)果計算
按下式計算還原糖的百分含量：
還原糖（％）＝查得的糖毫克數(shù)×樣品總體積×稀釋倍數(shù)/（測定時取用體積×樣品重×1000）×100