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士鋒生物雙向電泳常見問題
點擊次數：614 發布時間：2013-8-14
1. 重泡脹后的膠可以不用轉移到另一個電泳槽，直接跑 2D 的一向嗎？
一般情況下是可以的。但當上樣量特別大時，可能會有一部分蛋白質沒有被膠條吸收，這樣跑完 1D 和 2D 膠后，會有很多橫向條紋。所以在這種情況下，在重泡脹后，將膠條轉移到另外一個電泳漕中進行電泳。
2. 為什么我在等電聚焦前加的礦物油在聚焦后會減少，暴露出了膠條的背面？
這是因為 BioRad 的電泳槽有個蓋子。為了固定電泳槽中的膠條，這個蓋子上設計了對應的突起，以便壓住膠條。由于虹吸作用，這個突起會導引礦物油到相鄰的空電泳槽，從而降低有膠條的電泳槽中的礦物油液面。如果由此把膠條暴露在空氣中，那對等電聚焦的影響將是毀滅性的。為了防止這個現象的發生，可以在相鄰的空電泳槽里，也加入適量（ 80 ％滿）的礦物油。
3. 跑*向時，為什么要設定一個電流的zui大值電壓（50 μ A/ 膠）？
電流的平方和功率成正比。電流增大，功率增大，放出的熱量也隨之增大，就會導致膠條的溫度增加。當溫度超過 30 攝氏度時，緩沖液里的尿素就容易解離，產生一些極性分子，從而對等電聚焦產生影響。
4. 跑*向時，為什么剛開始的電壓比較低，而后逐漸增高？
剛開始時，體系內的帶電小分子比較多（比如無機鹽和雙極性分子）。所以在這個階段，電流主要是由這些小分子的移動所產生的。由于這些分子質量小，移動他們不需要很高的電壓。當這些小分子移動到他們的目的地時（無機鹽移動到極性相反的電極；兩性分子移動到對應的 pH 條帶），體系內的蛋白質才開始肩負起運載電流的任務，逐漸向所對應的 pH 區域移動。
5. 跑*向時，為什么會產生一條藍色的條帶，并逐漸向酸性端移動？
藍色條帶是緩沖液中痕量的溴酚藍被聚焦所產生的。溴酚藍也是 pH 指示劑，當它移動到酸性區時（ pH4 ），顏色會變成黃色。溴酚藍的這個移動過程大體上發生在極性小分子的聚焦之后，蛋白質大分子聚焦之前。
6. 跑*向時，為什么電壓總達不到預定值？
當上樣量比較大時或體系內鹽分比較多時，聚焦的電壓有可能達不到所設定的數值。
7. 跑*向時，在電壓達到預定值后，電流為什么會降低？
當上樣量比較少時，所有蛋白在較短的時間內就移動到所對應的 pH 值區域值，從而變成中性分子。這樣，體系的電阻越來越大，在恒定的電壓下，電流就會越來越小。
8. 跑*向時，為什么在兩個電極絲附近有氣泡產生？
等電聚焦完成后，所有的蛋白質都移動到了相應的 pI 值區域，而成為中心分子。這是加在體系上的電壓就開始電解水分子，在陽極產生氧氣，在陰極產生氫氣。
9. 重泡脹緩沖液（rehydration buffer）中的硫脲的作用是什么，雙極性分子的作用是什么？
硫脲的作用是增加蛋白質的溶解性，特別是堿性蛋白的溶解性。雙極性分子的作用也是增加蛋白質的溶解性。當蛋白移動到相應的 pH 值后，就變成了中性分子。而不帶電荷的蛋白質分子容易聚集，從而降低其在隨后的二向膠時的遷移效率，可能會造成豎的脫尾。而硫脲和雙極性小分子則會鑒定中性蛋白質之間的相互作用，防止它們的聚集。
10. 怎樣估計 2D 膠上蛋白質點的分子量和 pI 值？
可以用 BioRad 生產的 2D 膠標準蛋白來校準。也可以用體系內已知蛋白來做比對。
11. 為什么 2D 膠上的蛋白點有橫的和豎的脫尾？
橫的脫尾可能是： 1 ）一向等電聚焦不*； 2 ）某些蛋白質本身的原因（糖蛋白）； 3 ）蛋白的豐度太高。豎的脫尾是因為跑二向時，蛋白的溶解度不好。
12. 什么成分會影響 2D 膠的效果？
核酸，鹽，去垢劑等等。
13. 2D 膠的上樣量應該在什么范圍？
上樣量和樣品有關。樣品內蛋白種類多的上樣量要大些，這樣每個點才有足夠的量被檢測到。一般的全細胞裂解體系，上樣量大概在 100 微克（銀染）到 500 微克（考染）之間。
14. 我的蛋白質濃度很低，應該用什么方法來濃縮？
蛋白質的濃縮有很多方法。大致有超濾法，沉淀法和透析法。超濾比較溫和，對蛋白質不會有修飾和改變，蛋白的種類一般不會有丟失。它的缺點是總樣品的量可能會減少（被膜所吸附）。另外超濾對樣品的要求比較高。甘油，去垢劑都會堵塞濾膜，影響超濾的效果。沉淀法比較快速，容易操作，對鹽，甘油，去垢劑的耐受性好。缺點是可能會有部分種類的蛋白沒有被沉淀下來（丟失）。沉淀法中，又以 TCA 法zui為普遍使用。使用 TCA 法時，一定要用冷的純丙酮清洗蛋白沉淀兩次，去處殘留的 TCA 和其他沉淀下來的雜質。透析法只使用于量比較大的樣品，量小時，操作困難。 透析法可以和超濾法聯用。先把樣品透析到一個比較干凈的環境（ 不含鹽，甘油，去垢劑或其它雜質，比如碳酸氫氨溶液），然后再進行超濾。