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士鋒科技免疫金銀染色雙PAG法的操作步驟
點擊次數：1119 發布時間：2013-8-8
免疫金銀染色方法敏感、簡便、省時、安全可靠，葡萄球菌A蛋白（SPA）金標記四步法是在此基礎上發展起來的更為敏感的一種新方法。SPA和許多哺乳類動物IgG具有親和性，且它們之間的連接不會干擾抗原——抗體的結合。簡單的SPA金標記二步法后，第三步用抗SPA與SPA金表面分子通過Fab或Fc段相結合，結果結合更多的膠體金顆粒，再通過銀增強，使原始信號得到幾何級放大，其染色原理見圖。
雙PAG免疫金銀染色原理
（一）染色流程：
（1）石蠟切片常規脫蠟至水，0.05mol/L（pH7.4）TBS洗3×3min.
（2）0.1%胰蛋白酶37℃消化20min,或抗原修復20min（98℃），自然冷卻至室溫。
（3）0.05mol/L（pH7.4） TBS洗3×3min.
（4）1%EA（卵蛋白）15min,不洗。
（5）適當稀釋的特異抗體室溫4h或4℃孵育20h,或37C孵育30min.
（6）0.05mol/L（pH7.4）TBS洗3×5min.
（7）0.02mol/L（pH7.4）TBS（內含0.1%BSA）洗10min.
（8）1%EA 15min,不洗，滴加PAGlonm 1:40稀釋，室溫1h,
（9）0.05mo!/L（pH7.4）TBS洗10min.
（10）兔抗SPAIgGl:400稀釋，37℃ 30min.
（11）0.05mol/L（pH7.4）TBS洗10min.
（12）滴加PAGlonm 1:60稀釋，室溫1h,或37℃ 30min.
（13）0.05mol/L（pH7.4）TBS洗10min.
（14）1%戊二醛洗10min.
（15）雙蒸水洗5min.
（16）1%明膠洗5min.
（17）銀避光顯影8~15min.
（18）雙蒸水洗15min.
（19）固定：用顯影定影液（1:4或1:10）固定5min,也可以用15%硫酸鈉-20%硫代硫酸鈉混合液固定1~3rain，或用1%戊二醛固定5min,50℃溫水洗3~6min.
（20）襯染：核固紅襯染3min或甲基綠襯染3min.
（21）常規脫水，樹膠封片。
（22）鏡檢：陽性物質呈黑色或黑褐色，顆粒分布于抗原-抗體反應部位;背景較干凈，呈紅色。
（二）雙PAG法的敏感性
應用本法對keratin、AFP、HBsAg、FN、SOD、HCG、F8、P53等組織抗原的定位，連續4gm石蠟切片，同時用IGSS和雙PAG法，不同的一抗稀釋度，結果雙PAG法要比IGSS法敏感5~8倍，抗體的稀釋度從1: （1000~5000）提高到1: （10000-50000），大大節約了*抗體。尤其組織細胞內抗原性較弱，抗原丟失嚴重，應用雙PAG法均能得到有效的檢測，陽性檢測率和陽性強度有了明顯的提高。某些抗原用單一的SPA金標探針對某些抗原只能獲得低強度的染色，當用雙PAG法時可獲得強的特異性染色。