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[操作步驟] 1、 加樣：分別設標準孔、待測樣品孔、空白孔。設標準孔7孔，依次加入100μL不同濃度的標準品(見試劑準備2)。空白孔加100μL(見試劑準備第二步后一管)，余孔加待測樣品100μL，酶標板加上覆膜，37oC溫育2小時。

2、 棄去液體，甩干，不用洗滌。

3、 每孔加檢測溶液A工作液100μL(臨用前配制)，酶標板加上覆膜，37oC溫育1小時。

4、 棄去孔內液體，每孔用350μL的洗滌液洗滌，浸泡1-2分鐘，吸去(不可觸及板壁)或甩掉酶標板內的液體，在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標板朝下用力拍幾次(也可輕拍將孔內液體拍干)，重復洗板3次。后一次洗滌后，要把孔內的洗滌液*甩干。自動洗板機亦可。

5、 每孔加檢測溶液B工作液(臨用前配制)100μL，加上覆膜，37oC溫育30分鐘。

6、 棄去孔內液體，甩干，洗板5次，方法同步驟4。

7、 每孔加底物溶液90μL，酶標板加上覆膜，37oC避光顯色(反應時間控制在15-25分鐘，不要超過30分鐘。當標準孔的前3-4孔有明顯的梯度藍色，后3-4孔梯度不明顯時，即可終止)。

8、 每孔加終止溶液50μL，終止反應，此時藍色立轉黃色。終止液的加入順序應盡量與底物溶液的加入順序相同。如出現顏色不勻一，請輕輕晃動酶標板以使溶液混合均勻。

9、 在確保酶標板底無水滴及孔內無氣泡后，立即用酶標儀在450nm波長測量各孔的光密度(O.D.值)。