FastTaqMan Mixture（With ROX）說明書

Cat. No.   K2390

保存：-20℃避光

如需頻繁使用，2-8℃保存，盡量避免反復凍融。

組分說明

                          2×FastTaqMan Mixture

 Cat. No.     Kit Size                                          RNase-Free Water（With ROX）

K2390     50 μl 反應×40 次（1 ml）  1 ml                      1 ml

K2390A   50 μl 反應×200 次（5 ml） 5×1 ml                 5 ml

產品簡介

    FastTaqMan Mixture(With ROX)是專用于探針法(TaqMan，Molecular Beacon 等）實時熒光定量 PCR 的預混體系，濃度為 2×,包含 Fast Taq DNA Polymerase、PCR Buffer、dNTPs、Mg 2+ 和 ROX 校正染料，操作簡單方便。主要用于基因組 DNA 靶序列和 RNA 反轉錄后的 cDNA 靶序列檢測。本品含有的 Fast Taq DNA Polymerase，能有效減少在常溫條件下由引物和模板非特異性結合或引物二聚體而產生的非特異性擴增，酶的激活僅需在 95℃孵育 30s。整個 PCR 反應過程比普通反應可節省約 40 分鐘，大大縮短了 PCR 的反應時間。*的 PCR 緩沖體系與快速熱啟動酶的組合，有效抑制了非特異產物的產生，并顯著提高了 PCR 的擴增效率，熒光信號更強，靈敏度更高，線性范圍更寬。該產品適用范圍廣，可用于普通和快速定量 PCR 程序。所含的 ROX 染料可校正定量 PCR 儀孔與孔之間產生的熒光信號誤差, 適用于以 ROX 作為校正染料的熒光定量 PCR 儀。

注意事項

1     使用前請上下顛倒輕輕混勻，盡量避免起泡，并經短暫離心后使用。

2     本產品中含有熒光染料 ROX，保存本產品或配制 PCR 反應液時應避免強光照射。

3     避免反復凍融本品，反復凍融可能使產品性能下降。本產品長期保存可置于-20℃，避光。如果在短期內需要頻繁使 用，可在 2-8℃保存。  

使用方法

以下舉例為常規的反應體系和反應條件，實際操作中應根據模板、引物結構和目的片段大小的不同進行相應的改進和優化。

1.   PCR反應體系：

試劑                            50 μl反應體系     終濃度

2×FastTaqMan Mixture（With ROX）    25 μl                    1×

Forward Primer，10 µM                      1μl                0.2 μM 1）

Reverse Primer，10 µM                       1μl                 0.2 μM   1）

Probe，10  μM                                 1μl                0.2  μM  2）

Template DNA                                    2 μl 3）

RNase-Free Water                             up to 50  μl

     注意：1）通常引物濃度以0.2  μM可以得到較好結果，可以在0.1-1.0 μM作為設定范圍的參考。擴增效率不高的情況下，可提高引物的濃度；

發生非特異性反應時，可降低引物濃度，由此優化反應體系。

2）所用探針的終濃度，與使用的熒光定量PCR儀、探針種類、熒光標記物質種類有關，實際使用時請參照儀器說明書，或各熒光探針的具體使用要求進行濃度的調節。

3）通常DNA模板的量以10-100 ng基因組DNA或1-10 ng cDNA為參照，因不同物種的模板中含有的目的基因拷貝數不同，可對模板進行梯度稀釋，以確定最佳的模板使用量。

2.   PCR反應程序：

     兩步法PCR：

步驟                     溫度               時間

預變性                    95℃              30 s  1）

變性                     95℃              5 s       

                                            35-40 個循環

退火/延伸       2）        60℃              30 s

     注意：1）本產品所采用的酶須在預變性95℃、30s條件下實現酶的活化。在此條件下，大多數模板可良好的進行解鏈。對GC含量高、二級結構復雜的模板，可將預變性時間延長至1～4分鐘，以使起始模板充分解鏈。

2）建議采用兩步法PCR反應程序，若因使用Tm值較低的引物等原因，得不到良好的實驗結果時，可嘗試進行三步法PCR擴增，退火溫度請以  56℃-64℃的范圍作為設定參考。

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