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【收藏】一文讀懂熒光定量PCR儀
要說2020年熱門研究領及檢測技術，非熒光定量PC莫屬。僅2020上半年，公開采購PCR基因擴增儀機構數就是去年同期的2.5倍左右。今天，小析姐就和大家聊一聊常PCR的原理及相關技術，希望能對你的工作有所幫助。
PCR (polymerase chain reaction)聚合酶鏈式反應，又稱體外DNA擴增技術，在1985年由美國Cetus公司的Kary Mullis，可以將微量目的DNA擴增一百萬倍以上。Kary Mullis本人因此獲1993年諾貝爾化學獎。
熒光定量PCR（Real-time PCR），是指在PCR擴增反應體系中加入熒光基團，通過對擴增反應中每一個循環產物熒光信號的實時檢測,后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。
一、熒光定量PCR原理
以探針法熒光定量PCR為例：PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。開始時，探針完整地結合在DNA任意一條單鏈上，報告基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收，檢測不到熒光信號；PCR擴增時，Taq酶將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監測系統可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現了熒光信號的累積與PCR產物形成*同步。
傳統的PCR進行檢測時，擴增反應后需要進行染色處理及電泳分離，并且只能作定性分析，不能準確定量，易造成污染出現假陽性，使其應用受到限制。實時定量PCR技術不僅實現了對模板的定量，且具有靈敏度高、特異性和可靠性更好、自動化程度高和無污染的特點，使得熒光定量PCR逐漸取代常規PCR。
在PCR擴增反應的初數個循環里，熒光信號變化不大，接近一條直線，這樣的直線即是基線，這條線是可以自動生成也可以手動設置的。之后反應會進入指數增長期，這個期間擴增曲線具有高度重復性，在該期間，可設定一條熒光閾值線，它可以設定在熒光信號指數擴增階段任意位置上，但一般會將熒光閾值的缺省設置是 3-15 個循環的熒光信號的標準偏差的10 倍。每個反應管內的熒光信號到達設定的閾值時所經歷的循環數被稱為CT值，這個值與起始濃度的對數成線性關系，且該值具有重現性。
Ct值大的意義就是用來計算目的基因的表達量，此時就有兩個概念容易被提及，那就是定量和相對定量，定量的目的是測定目的基因在樣本中的分子數目，即通常所說的拷貝數。相對定量的目的是測定目的基因在兩個或多個樣本中的含量的相對比例，而不需要知道它們在每個樣本中的拷貝數。
Ct值誠然可以被利用來計算這兩種定量結果，但是定量實驗必須使用已知拷貝數的標準品，必須做標準曲線。相對定量可以做標準曲線，也可以不做標準曲線。標準品制作困難難以獲取，實驗室基本都是選擇相對定量的方法來計算相對基因表達量。