"在 HPTLC 系統中，每張板都代表一個新的分析體系。每次進行分析操作當天，在每個板上都應執行 SST，以驗證其是否符合實驗條件要求。SST 通常僅適用于包含預設限值在內的單個方法。如果 SST 失敗，則樣品檢測數據無效，無法進行評估。"
在高效薄層色譜 (HPTLC) 中，應用合適的系統適用性測試 (SST) 在每個薄層板上對分析系統進行驗證非常重要，是數據有效性的前提，一般是選擇幾個具有特定分析方法的化學對照物質作為參考。但目前常用的 SST 實驗設計具有一定的局限性，列舉《美國藥典》和《歐洲藥典》中關于 SST 的描述內容可見下表：
目前常用 SST 方法及其局限性
美國藥典 | 歐洲藥典 | |
關于 SST 的描述 | 使用 SST “檢查系統對分離度、位置和條帶顏色的適用性"，選擇 “在所用色譜條件下，由兩種或多種具有相似但可分離的RF 值的化合物" 作為參考物。 | SST 基于兩種具有相似 RF 值的物質的分離，但在規定的色譜條件下幾乎不可分離。 |
現有方法 局限性 | 美國藥典和歐洲藥典在定義中都描述了色譜圖特定區域內的分離情況。 對于每種方法，都需要開發一個新的系統適用性測試，非常耗時。 - 如果實驗室正在應用許多不同的 HPTLC 方法，則采購這些 SST 所需的化學參考物質可能會增加常規分析的大量成本。 - 不同 SST 系列的開發和驗證也非常耗時。 | |
SST 新思路
HPTLC 通用混標
針對上文列出的局限性，UHM 應運而生，可用于在常規分析中驗證 HPTLC 結果，實現對 HPTLC 色譜圖的整個 RF 范圍進行驗證。
什么是 UHM ？
UHM, the Universal HPTLC Mix，即高效薄層色譜通用混標，由 8 種不同性質的化合物組成，廣泛適用于各種 HPTLC 方法的 SST 測試。
HPTLC 通用混標 (UHM) 的開發
01
物質的選擇
- 選擇的物質最好具有安全、穩定、無需衍生化即可檢測、易于獲得且價格低廉等特點。據此，實驗人員從數以千計的物質列表中，選擇了 24 種化合物。
- 針對這 24 種化合物在 HPTLC 板上的色譜行為進行研究，分別用 20 種不同展開劑進行洗脫，涵蓋盡量廣泛的極性和選擇性，最終從中選擇了 8 種化合物：鳥苷、舒利苯酮、胸苷、撲熱息痛、鄰苯二甲酰亞胺、氫芴、噻噸酮和 2-苯并三唑四甲基丁基苯酚。
圖為 UHM 在不同展開系統下的色譜行為，在各條件下的選擇性均可保證至少 3 - 4 個有效化合物的條帶均勻分布在所需評估的范圍內
02
評估響應特性
- 相對濕度對每種物質的選擇性有不同的影響。當板的活性偏離預期的相對濕度 0 - 5%、33%、75% 或 100% 時，UHM 的響應特性可以清楚地檢測出這些偏離。
- 對甲苯-乙酸乙酯 90:10 (V/V) 的展開劑組成施加每種組分溶劑 ±10% 的變化，用 UHM 獲得的 HPTLC 指紋圖譜有顯著反應。
- 針對相同的展開劑進行不同飽和參數設置的考察（不飽和、部分飽和和充分飽和)。結果表明，部分飽和 RF 值相對增加，而*飽和 RF 值相對降低，UHM 可以檢測飽和操作的一般影響。
03
評估 UHM 性能
- 分別在實驗室內和實驗室間進行檢測，使用 3 種展開劑并得出 ΔRF，評估 UHM 性能。
- 在實驗室內試驗中，ΔRF 為 0.029; 實驗室間試驗為 0.040。
04
評估不同類型的硅膠薄層板
- 在色譜系統中薄層板的材料是一個關鍵參數。由于硅膠的規格不同，例如不同的粘合劑或熒光指示劑的存在，不同的薄層板可能會有不同的選擇性。
- 使用 UHM 評估了 6 種不同類型的涂敷型硅膠薄層板，使用相同的展開劑，乙酸乙酯-甲酸-乙酸-水 100:11:11:26 (V/V)。
UHM 與現行 SST 比較
使用 UHM 和現行的 SST 進行精油標準鑒別。
- 在原有方法中乙酸異丁香酚 [1a] 和異丁香酚 [1b] 被定義為 SST。作為特定標記物，使用的是芳樟醇和乙酸芳樟酯，或冰片和乙酸冰片酯。在這個例子中，還測試了 3 種精油：薄荷油、薰衣草油和肉豆蔻油。
- 針對 UHM 和當前 SST 的每個成分，計算平均 RF 值及其預測區間。下圖數據表明，UHM 成分的預測區間與原始 SST 的預測區間在同一范圍內。
UHM 成分的預測區間與原始 SST 的預測區間在同一范圍內
數據來源: CAMAG 與 Anchrom 印度合作實驗室
總結
- HPTLC 通用混標 (UHM) 是當前 SST 的一個很好的替代方法。
- 8 種不同極性、不同化學類別組分的混合物價格低廉、穩定，對驗證色譜系統的變化具有良好的響應性。
- 與當前的 SST 相比，UHM 的成分顯示出與已建立的 SST 的物質和特定標記物具有相似的預測區間。
- UHM 可以檢測展開劑梯度的變化或飽和效應，而許多已建立的 SST 通常只能描述有限的 RF 范圍。
會議內容重溫
由此可見，高效薄層色譜越來越受實驗人員的關注，原因不單在其快速、直觀、自由衍生的技術優勢，而且適用于復雜成分樣品的分離及檢測。從以上案例中，通過通用混標的應用，簡化 SST 方法開發周期，有效保證 HPTLC 在常規分析檢測中的數據重現性、有效性和可靠性。
CAMAG HPTLC PRO 全自動色譜系統實現連續多板之 “點樣 – 展開 – 衍生 – 檢測 – 分析 – 報告" 操作流程，是新一代的高效薄層色譜的技術。
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