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上海源葉生物科技有限公司
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葡萄球菌A蛋白（SPA）在免疫組化中的應用
2012-7-14 閱讀(516)
SPA可為多種示蹤物（如熒光素、酶、膠體金、鐵蛋白）所標記，應用較廣泛的為酶標記SPA和金標記SPA技術。標記SPA常用的酶為HRP，可應用于間接法染色，SPA在PAP法中可代替橋抗體。
1．SPA—HRP在間接法中的應用
由于SPA能結(jié)合IgG的Fc段，因此就成為天然的抗IgG，酶標記的SPA可代替酶標記的IgG抗血清，從而測定和定位組織內(nèi)的IgG或免疫復合物，SPA—HRP的染色步驟如下。
（1）石蠟切片常規(guī)脫蠟至水。
（2）3％H202處理15min，以抑制內(nèi)源性過氧化物酶
（3）TBS洗3X3min。
（4）加*抗體，孵育30～60min，或4~C過夜。
（5）TBS洗3X 3min。
（6）加適當?shù)南♂尩腟PA—HRP（1：100～1：400），孵育30—60min。
（7）TBS洗3X3min。
（8）DAB顯色5—10min。
（9）復染、脫水、封片。
2．SPA在PAP法中的應用
SPA除與標記物結(jié)合后用于代替第二抗體外，其本身可作為橋抗體用于PAP染色。與標記SPA相似，SPA可與多種動物的*抗體反應外，還可與多種PAP復合物反應，而不像PAP法需要與*抗體相同的動物制備的各種PAP復合物。由于SPA與Fc段和Fab段結(jié)合為親和化學反應，不是抗原—抗體的免疫反應，因而反應極為迅速，能大大減少實驗時間。此法的敏感性不如PAP法，但背景染色要低于PAP法，而且較為方便。染色步驟如下。 （1）4gm石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，PBS洗3X3rain。
（2）IHC的前處理視特異性一抗不同，可采用蛋白酶消化或熱誘導的微波抗原修復（AR）。
（3）PBS洗3X3min。
（4）3％過氧化氫（Hz02）孵育10min（可省略），以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性。
（5）PBS洗3X3min。
（6）20％蛋清[用0．01mol／L（pH7．3）PBS配制]孵育20min。
（7）PBS洗3X3min。
（8）10％非免疫性動物血清孵育10min（可省略），以減少非特異性背景，無需沖洗，只需吸去多余血清。
（9）滴加適當稀釋的*抗體，37~C溫育60min，或4~C過夜。
（10）PBS洗3X 3rain。
（11）加SPA（1ug／mi），37~C溫育30rain。
（12）PBS洗3X3rain。
（13）PAP復合物（兔或鼠）37~C溫育30min。
（14）PBS洗3X3rain。
（15）0．04％DAB（含0．03％Hz02）顯色5～10min
（16）復染，脫水，常規(guī)樹膠封固，結(jié)果觀察。
