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技術(shù)文章

成功完成WB檢測,必須滿足的4個(gè)條件

閱讀:3090          發(fā)布時(shí)間:2015-10-29

免疫印跡(immunoblotting)又稱蛋白質(zhì)印跡(Western blotting),是根據(jù)抗原抗體的特異性結(jié)合檢測復(fù)雜樣品中的某種蛋白的方法。該法是在凝膠電泳和固相免疫測定技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新的免疫生化技術(shù)。由于免疫印跡具有 SDS-PAGE 的高分辨力和固相免疫測定的高特異性和敏感性,現(xiàn)已成為蛋白分析的一種常規(guī)技術(shù)。免疫印跡常用于鑒定某種蛋白,并能對蛋白進(jìn)行定性和半定量分析。結(jié)合化學(xué)發(fā)光檢測,可以同時(shí)比較多個(gè)樣品同種蛋白的表達(dá)量差異。

成功完成Western Blot檢測,必須滿足4個(gè)條件:

凝膠洗脫:轉(zhuǎn)移期間蛋白質(zhì)必須從凝膠中洗脫出來,如果蛋白質(zhì)還截留在凝膠中,將無法在膜上進(jìn)行分析。

吸附到膜上:在轉(zhuǎn)移過程中蛋白質(zhì)必須吸附到膜上,如果蛋白不吸附,將無法在膜上進(jìn)行分析。

處理期間仍截留在膜上:在轉(zhuǎn)移后的處理過程中蛋白質(zhì)必須保持吸附在印跡膜上。

處理過程中可接近:被吸附的蛋白質(zhì)必須能夠與檢測試劑接觸,如果蛋白質(zhì)被掩蓋則無法檢測。

成功進(jìn)行WB檢測,則設(shè)置合適正確的對照是*的,只要正確設(shè)置了這些對照,即可快速和準(zhǔn)確的找到WB的問題所在,并保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和特異性!一般需要設(shè)置的對照如下:

陽性對照:明確表達(dá)檢測蛋白的組織或細(xì)胞,用于檢測抗體的工作效率。

陰性對照:明確不表達(dá)檢測蛋白組織或細(xì)胞,用于檢測抗體的特異性

二抗對照:不加一抗,用于檢測二抗的特異性

內(nèi)參對照:檢測標(biāo)本的質(zhì)量和二抗系統(tǒng)

空白對照:不加一抗和二抗;用于檢測膜的性質(zhì)和封閉的效果  

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