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Ramina 應(yīng)用實(shí)例｜實(shí)時監(jiān)測細(xì)胞培養(yǎng)性能測試
前言
拉曼光譜在復(fù)雜水體系中反映組分微小變化的能力深化了該技術(shù)在生物制藥過程分析（如生物反應(yīng)器中的細(xì)胞生長）方面的應(yīng)用。拉曼光譜儀技術(shù)可以實(shí)時、原位和無損地監(jiān)測生物制藥生產(chǎn)過程，可用于復(fù)雜化學(xué)體系的連續(xù)過程監(jiān)測。拉曼光譜技術(shù)在生物反應(yīng)過程中可檢測大量代謝物變化的能力已將該技術(shù)提升為強(qiáng)大的過程分析工具。
實(shí)驗(yàn)概述
拉曼光譜分析光學(xué)探頭具有可重復(fù)使用的特點(diǎn)，通過減少運(yùn)行間的可變性來提高過程監(jiān)測的可重復(fù)性和可靠性。Thermo Scientific™ Ramina™ 過程分析儀可匹配多個光纖探頭。MarqMetrix 生物反應(yīng)器球形探頭是專為滿足生物工藝工業(yè)的要求而設(shè)計的，可以搭載到 Ramina 過程分析儀上使用。這些探頭具有快速、易于更換和連接以及耐用等特點(diǎn)，可以進(jìn)行無菌處理，比如離線的高壓滅菌。
DynaDrive 一次性生物反應(yīng)器(S.U.B.)是 S.U.B. 技術(shù)的最新產(chǎn)品，為大規(guī)模生物生產(chǎn)提供了更好的性能，并具備可擴(kuò)展性。與傳統(tǒng)的 S.U.B. 設(shè)計相比，長方體的罐體具有幾個關(guān)鍵優(yōu)勢，包括*的混合和傳質(zhì)能力以及更好的可擴(kuò)展性。
本應(yīng)用介紹了Ramina過程分析儀系統(tǒng)與 500L HyPerforma DynaDrive 生物反應(yīng)器的集成，并實(shí)現(xiàn)關(guān)鍵過程參數(shù)(CPPs)的在線測量，通過采集整個細(xì)胞生長培養(yǎng)過程中連續(xù)生成的光譜數(shù)據(jù)建立起若干參數(shù)和代謝物的精確預(yù)測模型。
材料與方法
細(xì)胞培養(yǎng)和喂養(yǎng)策略
細(xì)胞培養(yǎng)在500L HyPerforma DynaDrive S.U.B 中進(jìn)行（見下圖1），其中包含體積約為320L細(xì)胞培養(yǎng)基，在36.5℃，pH=6.9+/-0.3, DO=50%的條件下接種0.5x106個細(xì)胞/mL。體系的 pH 值通過添加二氧化碳?xì)怏w和碳酸鈉來控制。
細(xì)胞在化學(xué)定義的培養(yǎng)基中生長，從第3天開始每天進(jìn)行兩步喂養(yǎng)過程。第一種喂養(yǎng)介質(zhì)以起始體積的重量為4%添加，第二種喂養(yǎng)介質(zhì)以0.4%添加。第6天體系溫度轉(zhuǎn)為33°C。試驗(yàn)在14天后終止。生物反應(yīng)器避光處理以防止雜散光干擾。在高壓滅菌后，將 Ramina 過程分析儀生物反應(yīng)器球形探頭插入HyPerforma DynaDrive S.U.B. 中，進(jìn)行在線實(shí)時拉曼光譜數(shù)據(jù)采集。
圖1.500L Thermo Scientific HyPerforma
DynaDrive S.U.B. 細(xì)胞培養(yǎng)罐
Ramina 過程分析儀測試
使用 Ramina 過程分析儀進(jìn)行數(shù)據(jù)采集（見下圖2）， Ramina 過程分析儀的生物反應(yīng)器球形探頭直接浸入在生物反應(yīng)器(500L) 中，每平均20次測量獲取一張拉曼光譜數(shù)據(jù)，積分/曝光時間為3秒，激光功率設(shè)置為450mW。每個數(shù)據(jù)光譜的總采集時間為2分鐘，在 Ramina 過程分析儀用以建立模型數(shù)據(jù)與離線儀器分析通過匹配時間戳以確認(rèn)。
圖2.Thermo Scientific™ Ramina™
在線拉曼分析儀
化學(xué)計量學(xué)模型建立
來自多臺 Ramina 過程分析儀、探頭和生物反應(yīng)器的數(shù)據(jù)被用于創(chuàng)建模型。訓(xùn)練數(shù)據(jù)集從每個生物反應(yīng)器的45個樣本中收集，以創(chuàng)建每個化學(xué)計量學(xué)模型。對光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行了檢查，剔除了由宇宙射線引起的異常譜峰。選擇感興趣的光譜區(qū)域，并對光譜進(jìn)行預(yù)處理，以去除基線干擾并優(yōu)化信噪比。
建模過程中測試了許多預(yù)處理技術(shù)，包括Savitzky Golay濾波、自動Whitaker平滑、多元散射校正、SNV和均值中心化。根據(jù)建模的關(guān)注點(diǎn)選擇優(yōu)化不同的預(yù)處理技術(shù)。為每個感興趣的組分創(chuàng)立偏最小二乘(PLS)模型并進(jìn)行交叉驗(yàn)證以測試每個模型的優(yōu)化的效果。這些組分包括葡萄糖、乳酸、谷氨酰胺、谷氨酸、TCD、VCD和其他在生物反應(yīng)器培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的常見代謝物。
結(jié)果
在這項(xiàng)工作中，在線拉曼光譜儀應(yīng)用于連續(xù)分批補(bǔ)料 CHO 細(xì)胞培養(yǎng)過程。使用拉曼光譜監(jiān)測工藝參數(shù)首先需要使用外部校準(zhǔn)數(shù)據(jù)集（獨(dú)立離線數(shù)據(jù)）建立化學(xué)計量學(xué)模型，通過對感興趣的參數(shù)的離線分析數(shù)據(jù)和對應(yīng)的在線拉曼光譜數(shù)據(jù)的關(guān)聯(lián)關(guān)系建立模型。
為了評估 Ramina 過程分析儀預(yù)測值的準(zhǔn)確性，每天收集生物反應(yīng)器數(shù)據(jù)并進(jìn)行分析比較。計算每個參數(shù)(RMSEP)的校準(zhǔn)均方根誤差(RMSEC)、交叉驗(yàn)證均方根誤差 (RMSECV)和預(yù)測均方根誤差。根據(jù)模型的預(yù)測計算平均誤差，得到用于構(gòu)建模型的 RMSECV。用模型未見過的“新"數(shù)據(jù)來測試模型，依據(jù)參數(shù)RMSEP判斷。為每個 PLS 模型記錄變異系數(shù) R2。該值用于確定模型預(yù)測變量（X 變量）可以解釋的 Y 變量的變化量。
值得一提的是，結(jié)合使用來自同一 CHO 培養(yǎng)過程的生物反應(yīng)器運(yùn)行的幾個大型獨(dú)立數(shù)據(jù)集，可以產(chǎn)生更準(zhǔn)確和穩(wěn)健的預(yù)測化學(xué)計量學(xué)模型。在這項(xiàng)研究中，來自之前生物反應(yīng)器運(yùn)行的五個獨(dú)立數(shù)據(jù)集被組合起來訓(xùn)練一個大型化學(xué)計量學(xué)模型。然后將校準(zhǔn)模型應(yīng)用于此次 Hyperforma DynaDrive S.U. B 生物反應(yīng)器的預(yù)測。數(shù)據(jù)表明該模型能夠準(zhǔn)確預(yù)測這個新數(shù)據(jù)集，并且模型預(yù)測與離線收集的眾多代謝物的數(shù)據(jù)測量高度相關(guān)，如下表1所示。
表1.模型預(yù)測值與離線數(shù)據(jù)的相關(guān)性
下圖為賽默飛Hyperforma DynaDrive S.U.B.化學(xué)計量學(xué)模型預(yù)測——各重要參數(shù)的拉曼預(yù)測模型和離線數(shù)據(jù)對比。
結(jié)論
可重復(fù)使用MarqMetrix生物反應(yīng)器BallProbe 探頭具有TouchRaman浸沒技術(shù)，連接Ramina過程分析儀，可對500L HyPerforma DynaDrive S.U.B.中的關(guān)鍵過程參數(shù)葡萄糖、谷氨酰胺和乳酸以及總細(xì)胞密度和活細(xì)胞密度進(jìn)行準(zhǔn)確的在線實(shí)時預(yù)測。相關(guān)性分析顯示模型預(yù)測數(shù)據(jù)與離線分析數(shù)據(jù)之間具有良好的一致性，表明模型能穩(wěn)健地應(yīng)用于上表1中所示參數(shù)的預(yù)測。