WB常見問題及對策

一、不好看的條帶

1.不好看的條帶大多是因為蛋白酶降解，造成條帶出現在奇怪的位置。建議使用已經保存在冰上的新鮮樣品或換抗體。

2.如果蛋白質位置比較高，重新加熱樣本可以幫助打破蛋白質的結構。

3.模糊的條帶經常是因為轉染過程中電壓過高或氣泡，應確保凝膠在較低的電壓下運行，以及轉染的三明治避免產生氣泡。另外，換新的電泳緩沖液可能也可以幫助解決問題。

4.條帶不平滑，可能是由于阻力低導致穿過蛋白質凝膠的速度過快，因此要選用質量較好的樣品。

5.白色條帶是由于蛋白質或抗體太多了。

二、條帶缺失

1.一抗或二抗有問題。

2.抗體濃度太低。

3.有些抗體不能用于WB。

4.轉膜液、TBST、電泳緩沖液或ECL比較陳舊或有質量問題。

5.抗體中加入了疊氮化NA， 干擾ECL發光。

三、 目的蛋白信號弱

1.條帶信號弱可能是抗體或抗原濃度低造成的，可以嘗試增加曝光時間。

2.另一個原因可能是脫脂奶粉掩蓋了抗原。在這種情況下使用BSA 或減少使用的牛奶量。

四、背景過高

1.高背景通常是由于與PVDF膜結合的抗體濃度過高造成的。

2.另一個可能是緩沖液太舊?？梢栽囋嚩嘞匆粫?。

3.曝光也可能導致背景過高。建議試試不同的曝光時間來找到最佳時間。

五、條帶上的斑點

1.條帶上出現斑點可能是轉膜的問題。如果有氣泡出現在凝膠和膜之間，會在條帶上顯示很暗的影，因此趕氣泡是很重要的。

2.洗背景是至關重要的。

3.可能是由于二抗的聚合，在這種情況下，二抗可以離心并過濾以去除聚合體。

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