抗壞血酸氧化酶（ascorbate oxidase，AAO）活性測定試劑盒說明書

分光光度法 50 管/48 樣

抗壞血酸氧化酶活性測定試劑盒

正式測定前務(wù)必取 2-3 個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定測定意義：

AAO 是定位于植物細(xì)胞壁的糖蛋白，屬“藍(lán)銅氧化酶”家族。細(xì)胞壁內(nèi)的抗壞血酸和AAO 與細(xì)胞壁的代謝和生長有著密切的聯(lián)系。AAO 氧化 AsA 所形成的 MDHA 可通過質(zhì)膜上的細(xì)胞色素b 還原，該過程中電子的跨膜運(yùn)輸能夠促進(jìn)細(xì)胞生長。

測定原理：

AAO 可直接氧化AsA，通過測定AsA 的氧化量，可計(jì)算得 AAO 活力。

組成：

試劑三：粉劑×1 瓶，4℃保存。臨用前加入 5ml 蒸餾水充分溶解。

自備儀器和用品：

低溫離心機(jī)、紫外分光光度計(jì)、1ml 石英比色皿、可調(diào)式移液器、研缽、冰、蒸餾水。

粗酶液提取：

按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1ml 試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿。16000g，4℃離心 10min，取上清置冰上待測。

AAO 測定操作：

分光光度計(jì)預(yù)熱 30 min，調(diào)節(jié)波長到 265 nm，蒸餾水調(diào)零。

試劑二在 25℃水浴鍋中預(yù)熱 30 min。

依次在 1 ml 石英比色皿中加入 100μl 上清液、850μl 預(yù)熱的試劑二和 50μl 試劑三，迅速混勻后在 265nm測定 10 s 和 130 s 光吸收A1 和A2，△A =A1-A2。

AAO 活性計(jì)算公式：

按蛋白濃度計(jì)算

AAO 活性單位定義：25℃中每毫克蛋白每分鐘氧化 1nmol AsA 為 1 個酶活單位。

AAO(nmol/min /mg prot) = △A÷(ε×d）×V 反總×109÷(Cpr×V 樣)÷T

= 92.4×△A÷Cpr

按樣本質(zhì)量計(jì)算

AAO 活性單位定義：25℃中每克樣本每分鐘氧化 1nmol AsA 為 1 個酶活單位。

AAO(nmol/min/g 鮮重) = △A÷(ε×d）×V 反總×109÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T

= 92.4×△A÷W

ε：AsA 在 265nm 處摩爾吸光系數(shù)為 5.42×104 L/mol/cm；d：比色皿光徑（cm），1 cm；V 反總：反應(yīng)體系總體積（L），1000μl=1×10-3 L；106：1mol=1×109nmol；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度（mg/ml），需要另外測定，建議使用本公司 BCA 蛋白質(zhì)含量測定試劑盒；V 樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積（ml），100μl=0.1 ml；V 樣總：加入提取液體積，1ml；W，樣本質(zhì)量，g；T：催化反應(yīng)時(shí)間（min），2min。

注意事項(xiàng):

配制好的試劑放在 4℃保存，三天內(nèi)使用完。

抗壞血酸氧化酶活性測定試劑盒