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多肽合成的建立，了解一下！2021/11/23

多肽固相合成法是多肽合成有機化學(xué)的一個重大的提升。它的最大的優(yōu)點是不必純化中間物質(zhì)，合成過程能夠連續(xù)開展，從而為多肽合成的自動化奠定了基本。目前全自動多肽的合成，基本上全是固相合成。其主要過程以下：根據(jù)Fmoc化學(xué)合成，先將所需合成的目標(biāo)多肽的C-端氨基酸的羧基以共價鍵形式與一個不可溶的高分子樹脂相接，然后以這一氨基酸的氨基做為多肽合成的起始點，同其他的氨基酸早已活化的羧基功效產(chǎn)生肽鍵，持續(xù)重復(fù)這一過程，就可以獲得多肽。依據(jù)多肽的氨基酸構(gòu)成不一樣，多肽后處理方法不一樣，純化方法也是有差別。1.做

蛋白質(zhì)純化對策與考慮原因了解一下2021/11/23

1、在開展一個蛋白純化以前，應(yīng)當(dāng)對其蛋白有一定的科學(xué)研究，包含其性質(zhì)，敏感性，比如該蛋白的溶解度，對高鹽或pH比較敏感，是不是非常容易空氣氧化等；2、需要考慮蛋白的主要用途，來決定制取蛋白的數(shù)量級規(guī)模，這就需要充分考慮層析柱的規(guī)格，獲得的蛋白濃度值怎樣，是不是需要維持其活力及其防止多余的污染物；3、蛋白的檢驗方式，針對帶有不一樣成分的蛋白水溶液，其檢驗方式一般不一樣，融合其敏感度，正確度，精確性等綜合性考慮在不一樣純化流程中采用不一樣的檢驗方式；4、蛋白緩沖液添加劑，出自于提升蛋白可靠性，避免微

不同的領(lǐng)域使用不同的生物緩沖液2021/11/22

緩沖液是一種能在加入少量的酸或堿和水時抵抗PH改變的溶液，，PH緩沖系統(tǒng)對維持生物的正常PH值、生理環(huán)境起到重要的作用。多所以它在生物化工領(lǐng)域運用是非常廣泛的，研究工作中的溶液體系PH值的變化會直接影響到實驗的成效。生化實驗中常見的生物緩沖劑包括TRIS（三羥甲基氨基甲烷）、HEPES(4-羥yi基哌qin乙磺酸)、CAPS（3-（環(huán)己胺）-1-丙磺酸)、BICINE(二羥yi基甘氨酸)等，接下來我們來看一看它們都常用在什么領(lǐng)域中。1、TRIS（三羥甲基氨基甲烷）常用于生物化學(xué)和分子生物學(xué)實驗當(dāng)

蛋白純化實驗中生物緩沖液的選擇2021/11/22

蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能需要在合適的pH值環(huán)境中才能維持，因此在蛋白的制備及純化過程中，生物緩沖液的選擇非常重要，只有合適的緩沖液才能保證蛋白的活性和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。蛋白純化過程緩沖液作用用于蛋白純化的緩沖劑有很多種，在維持體系的pH同時，要保證蛋白在純化過程中不能失活，或者是盡量減少蛋白失活的量，在蛋白純化的每一個步驟中都要保持蛋白的可溶性和活性。蛋白純化緩沖液要求蛋白純化過程中的緩沖液既要防止蛋白降解，也要防止蛋白聚合，其對實驗結(jié)果影響顯著。在選擇和試劑緩沖液時應(yīng)考慮以下幾個因素：pH值、緩沖體系、鹽離

哪些原因會導(dǎo)致酶制劑的失活？2021/11/22

一、PH值的影響每種酶僅在特定的pH范圍內(nèi)才表現(xiàn)出較高的活力，該pH值即是酶作用的合適pH值，酶在合適pH值表現(xiàn)就會很穩(wěn)定。若酶反應(yīng)pH值過高或過低，酶都會受到不可逆的破壞，穩(wěn)定性、活力下降，甚至失活。而且不同酶的合適pH范圍不同，偏酸性、中性、偏堿性的都有。二、溫度的影響在一定條件下，每種酶都有一個合適作用的溫度，在此溫度下酶活力zui高，作用效果zui好，酶也較穩(wěn)定，酶催化反應(yīng)的速度增加和酶活力的熱變性損失達到平衡，這個溫度便是酶作用的合適溫度。每種酶都有一個活性穩(wěn)定的溫度，在此溫度下在一定

做實驗不會制備“細胞爬片”怎么行？2021/11/22

我們在做免疫熒光（IF），激光共聚焦(Confocal)，凋亡檢測（TUNEL）時，免不了要制備細胞爬片，爬片質(zhì)量*決定了最后拍照的質(zhì)量以及實驗數(shù)據(jù)的精準(zhǔn)性。今天，小編就教大家如何制備好的細胞爬片。爬片的準(zhǔn)備1.爬片可用一般的蓋玻片，也可用專用細胞爬片（價格比較昂貴）但是細胞貼壁牢固，拍出照片效果好；2.可根據(jù)自己的需要，到染色時再將之切開，這樣既保證了細胞均一性，又可同時做幾個指標(biāo)的染色剪裁成合適大小，置于6孔板、12孔板或24孔板；細胞爬片（以常用24孔板為例）1.胰酶消化細胞后計數(shù)重懸細胞

IHC免疫組化常見問題分析2021/11/19

分析一下免疫組化實驗中一些常見的問題和解決措施：常見問題一：所有切片呈陰性原因分析：a.緩沖液內(nèi)含疊dan化鈉，抑制酶的活性；b.染色未*按照操作步驟進行；c.漏加一種抗體或抗體失活；d.復(fù)染或脫水劑使用不當(dāng)；e.底物中加入的過氧化氫少或失活。解決措施：設(shè)立“陽性對照”。如果陽性對照有了表達，說明染色的全過程和所有試劑都沒有問題。如果此時測試片仍為陰性，便是真實的陰性，說明組織或細胞沒有相應(yīng)的抗原表達。常見問題二：所有切片呈陽性原因分析：a緩沖液配置中未加氯化鈉和PH值不準(zhǔn)確，洗滌不*；B使用已

實驗天天做，蛋白還是表達不好？2021/11/19

哺乳動物表達系統(tǒng)克服了原核表達系統(tǒng)翻譯后修飾蛋白表達的問題。表達的蛋白具備折疊和修飾的功能，高度人源化，可以用于結(jié)構(gòu)、功能分析。利用哺乳動物細胞表達蛋白通常有兩種方式：瞬時表達與穩(wěn)定轉(zhuǎn)染（構(gòu)建穩(wěn)定細胞系）。利用細胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染將外源基因轉(zhuǎn)染至細胞染色體上，能夠長期穩(wěn)定地生產(chǎn)目的蛋白。但是實驗成本高、周期長、操作難度大。瞬時蛋白表達是指外源基因存在于游離的載體上，并沒有轉(zhuǎn)染到細胞的染色體。構(gòu)建好質(zhì)粒后，經(jīng)過細胞復(fù)蘇、轉(zhuǎn)染、細胞培養(yǎng)、蛋白純化等步驟即可得到目的蛋白。操作簡單，實驗成本低，周期短，最shi

細胞爬片也可以很簡單~2021/11/19

爬片又名細胞爬片，是指讓玻片浸在細胞培養(yǎng)基內(nèi)，細胞在玻片上生長，主要用于組織學(xué)，免疫組織化學(xué)，病凍切片，細胞涂片，原位雜交等。細胞爬片特點1.玻片表面經(jīng)過TC處理，雙面均可使用.2.γ射線滅菌,保證無菌.3.使用便捷,只需打開包裝,將爬片放入孔板內(nèi),將細胞懸液滴到爬片上即可培養(yǎng).4.爬片厚度為0.17mm,直徑為8mm/14mm/20mm/25mm.分別適用于48孔細胞培養(yǎng)板/24孔細胞培養(yǎng)板/12孔細胞培養(yǎng)板/6孔細胞培養(yǎng)板5.*吸附：該玻片表面具有yong久的陽離子電荷,可以通過靜電作用吸附

馬住！流式細胞術(shù)實用技巧！2021/11/19

流式細胞技術(shù)（flowcytometry，F(xiàn)CM）是利用流式細胞儀進行的一種單細胞定量分析和分選技術(shù)。流式細胞術(shù)是單克隆抗體及免疫細胞化學(xué)技術(shù)、激光和電子計算機科學(xué)等高度發(fā)展及綜合利用的高技術(shù)產(chǎn)物。一、基本結(jié)構(gòu)流式細胞儀由三部分構(gòu)成1.液流系統(tǒng)，包括流動室和液流驅(qū)動系統(tǒng);2.光學(xué)系統(tǒng)，包括激發(fā)光源和光束收集系統(tǒng);3.電子系統(tǒng)，包括光電轉(zhuǎn)換器和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)。流式細胞儀的I作原理是使懸浮在液體中分散的經(jīng)熒光標(biāo)記的細胞或微粒逐個通過樣品池，同時由熒光探測器捕獲熒光信號并轉(zhuǎn)換成分別代表前向散射角、側(cè)向散

怎么建穩(wěn)轉(zhuǎn)株才能真的穩(wěn)？2021/11/18

穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，即進入細胞的質(zhì)粒整合入細胞基因組中，并能隨細胞分裂穩(wěn)定傳遞下去。這是相對瞬時轉(zhuǎn)染而言的。瞬時轉(zhuǎn)染的表達時間短暫，外源基因?qū)胝匣蚪M的幾率非常低，絕大部分以游離形式存在，不能隨細胞分裂而一同復(fù)制，導(dǎo)致最后拷貝數(shù)被稀釋，無法達到持續(xù)表達外源基因的目的。一般用轉(zhuǎn)染試劑進行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，多為瞬時轉(zhuǎn)染。一般如下情況需要構(gòu)建穩(wěn)定株：1)長期在目的細胞中研究基因功能，通過構(gòu)建穩(wěn)定株，可以大大降低頻繁轉(zhuǎn)染或者病毒包裝的成本，也非常方便實驗研究；2)部分蛋白半衰期極長，瞬時RNA只能干擾表達，無法去除已

流式與磁珠分選你pick哪個？2021/11/18

細胞分選在多種研究領(lǐng)域都有涉及，例如腫瘤學(xué)，神經(jīng)生物學(xué)，免疫學(xué)等。但是大家對它們的優(yōu)缺點可能不太清楚，那今天遠慕生物在這里跟大家聊一下流式分選的原理、應(yīng)用及與磁珠分選的區(qū)別。流式細胞儀分選原理當(dāng)經(jīng)熒光染色或標(biāo)記的單細胞懸液放入樣品管中，被高壓壓入流動室內(nèi)。流動室內(nèi)充滿鞘液，在鞘液的包裹和推動下，細胞被排成單列，以一定速度從流動室噴口噴出。在流動室的噴口上配有一個超高頻的壓電晶體，充電后振動，使噴出的液流斷裂為均勻的液滴，待測細胞就分散在這些液滴之中。將這些液滴充以正、負不同的電荷，當(dāng)液滴流經(jīng)過帶

關(guān)于無血清培養(yǎng)基知識你不得不知~2021/11/18

無血清培養(yǎng)基是在合成培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，與傳統(tǒng)的培養(yǎng)基相比，既能滿足細胞在體外長時間培養(yǎng)的要求，又能避免動物血清所帶來的不利因素。無血清培養(yǎng)基的發(fā)展歷程分為無血清培養(yǎng)基（Serum-FreeMedium，SFM）、無動物源培養(yǎng)基（AnimalComponentFreeMedium，ACFM）、無蛋白培養(yǎng)基（Protein-FreeMedium，PFM）及化學(xué)成分限定培養(yǎng)基（ChemicallyDefinedMedium，CDM）等四類。在使用無血清培養(yǎng)基時，有些細胞需要逐漸適應(yīng)，即先將原來

你還搞不清楚病毒載體的用法？2021/11/18

基因表達載體是廣大科研人員普遍需要的研究工具，而病毒載體憑借其優(yōu)良效能則越來越成為最shou歡迎、也最為普遍的基因表達載體。然而病毒載體也分為好幾類，不同實驗類型、不同研究目的、不同“受體”性質(zhì)需要我們準(zhǔn)確評估與選擇。因此，詳細了解不同病毒載體的相關(guān)知識是我們科研人員必須掌握的。本文詳細介紹了常見病毒載體的原理、特點和適用范圍。一、慢病毒載體慢病毒（Lentivirus）屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒的一種，有由于其感染潛伏期較長，臨床癥狀發(fā)展緩慢，被稱為慢病毒。而慢病毒載體則是在慢病毒的基礎(chǔ)上改變重組其構(gòu)成原

化學(xué)實驗基本操作中的“錯”與“對”2021/11/17

1.試管的握持出錯點：用手一把抓或?qū)o名指和小指伸展開；位置靠上或靠下。正確方法：“三指握兩指拳”.即大拇指、食指、中指握住試管，無名指和小指握成拳，和拿毛筆寫字有點相似。手指握在試管中上部。2.藥品的取用出錯點：A.取粉末狀藥品，由于藥匙大，加藥品時不能深入容器內(nèi)致使灑落或粘附容器內(nèi)壁，而不知用V形紙槽代替藥匙送藥品入容器內(nèi)。B.傾倒液體藥品時，試劑瓶口沒緊挨接受器口致使藥品外流，標(biāo)簽沒向著手心，造成標(biāo)簽被腐蝕。正確方法：A.取用粉末狀或細粒狀固體，通常用藥匙或紙槽。操作時，做到“一送、二豎、

薄層色譜的分離原理、條件選擇和操作方法2021/11/17

一、薄層色譜概念最chang用的薄層色譜也屬于液-固吸附色譜。同柱色譜不同的是吸附劑被涂布在玻璃板上，形成薄薄的平面涂層。干燥后在涂層的一端點樣，豎直放入一個盛有少量展開劑的的有蓋容器中。展開劑接觸到吸附劑涂層，借毛細作用向上移動。與柱色譜過程相同，經(jīng)過在吸附劑和展開劑之間的多次吸附-溶解作用，將混合物中各組分分離成孤立的樣點，實現(xiàn)混合物的分離。除了固定相的形狀和展開劑的移動方向不同以外，薄層色譜和柱色譜在分離原理上基本相同。由于薄層色譜操作簡單，試樣和展開劑用量少，展開速度快，所以經(jīng)常被用于探

實驗室常用稱量儀器使用方法2021/11/17

1、臺秤臺秤用于精度不高的稱量，一般只能稱準(zhǔn)到0.1g。稱量前，首先調(diào)節(jié)托盤下面的螺旋，讓指針在刻度板中心附近等距離擺動，此謂調(diào)零點。稱量時，左盤放稱量物，右盤放砝碼（10g或5g以下是通過移動游碼添加的），增減砝碼，使指針也在刻度板中心附近擺動。砝碼的總質(zhì)量就是稱量物的質(zhì)量。稱量時應(yīng)注意：1）不能稱量熱的物體；2）稱量物不能直接放在托盤上，依情況將其放在紙上，表面皿中或容器內(nèi)；3）稱量完畢，一切復(fù)原。2、光電天平光電天平叫光學(xué)天平。分為雙盤和單盤兩種，下述為雙盤光電天平。它最大載重量為200g

轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)你還在傻傻分不清2021/11/16

一、什么是轉(zhuǎn)染?從廣義上講,轉(zhuǎn)染是采用除病毒感染外的其他方法將核酸(DNA或RNA)人工導(dǎo)入細胞的過程。采用各種化學(xué)、生物學(xué)或物理方法導(dǎo)入外源性核酸會改變細胞的特性,從而實現(xiàn)細胞基因功能和蛋白質(zhì)表達研究。轉(zhuǎn)染后,導(dǎo)入的核酸可以瞬時性地存在于細胞內(nèi),只表達一段時間且不會復(fù)制,也可以穩(wěn)定地整合至受體基因組內(nèi),隨著宿主基因組的復(fù)制而復(fù)制,各種基因輸送系統(tǒng)采用的術(shù)語與該領(lǐng)域的技術(shù)進展步調(diào)一致,并進一步區(qū)分不同的方法和細胞類型。1、轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染通常是指將核酸輸送到真核細胞,或者更明確地說是輸送到動物細胞內(nèi)。術(shù)

細胞轉(zhuǎn)染實驗分析看這篇就對了~2021/11/16

細胞轉(zhuǎn)染是指將外源分子如DNARNA等導(dǎo)入真核細胞的技術(shù)。可分為瞬時轉(zhuǎn)染，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染等。瞬時轉(zhuǎn)染是指外源DNA/RNA不整合到宿主染色體中，因此一個宿主細胞可存在多個拷貝數(shù)，產(chǎn)生高水平的表達，但通常只持續(xù)幾天，多用于啟動子和其他調(diào)控元件的分析。一般來說，超螺旋質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染效率較高，在轉(zhuǎn)染后24-72h內(nèi)分析結(jié)果，常常用到一些報告系統(tǒng)如熒光蛋白，β半乳糖苷酶等來幫助檢測。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染是指外源DNA既可以整合到宿主染色體中，也可能作為一種游離體存在。盡管線性DNA比超螺旋DNA轉(zhuǎn)入量低但整合率高。外源D

PCR/RT-PCR還有不懂的？看這篇！2021/11/16

1.問題：RT-PCR靈敏度：在瓊脂糖凝膠分析中看到少量或沒有RT-PCR產(chǎn)物。可能原因：1）RNA被降解(如何確定RNA是否被講解，詳見前“植物RNA的提取”。建議解決方法：在用來驗證完整性之前先在變性膠上分析RNA使用良好的無污染技術(shù)分離RNA；在將組織從動物體取出后立刻處理在100％甲酰胺中儲存RNA；如果使用胎盤RNase抑制劑，不要加熱超過45℃或pH超過8.0，否則抑制劑或釋放所有結(jié)合的RNase。而且，在≥0.8mMDTT時加入RNase抑制劑，一定要存在DTT。2）RNA中包含逆