染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）是目前研究體內(nèi)DNA與蛋白質(zhì)相互作用的重要工具。雖然ChIP技術(shù)的原理不復(fù)雜，但是對(duì)技術(shù)的要求高，實(shí)驗(yàn)步驟的設(shè)計(jì)摸索耗時(shí)耗力，實(shí)驗(yàn)耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)。也許您從未開展過ChIP，也許您的ChIP結(jié)果有待改善，那么，可以看看下面的4點(diǎn)建議。

是否需要交聯(lián)？

交聯(lián)的目的是將感興趣的抗原固定在其染色質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)。若沒有交聯(lián)的步驟，就意味著只有與染色質(zhì)結(jié)合非常緊密的蛋白質(zhì)能被免疫沉淀，譬如組蛋白。若您的研究對(duì)象是組蛋白，那可能不需要交聯(lián)，而其他蛋白，如轉(zhuǎn)錄因子和DNA結(jié)合復(fù)合物中包含的蛋白，可能還需要交聯(lián)。如果使用交聯(lián)，則ChIP反應(yīng)被稱為X-ChIP，則天然的ChIP反應(yīng)被稱為N-ChIP。然而，確實(shí)有一些抗原不適合用X-ChIP這種方式，因?yàn)樵诮宦?lián)過程中它們的表型會(huì)發(fā)生變化，或出現(xiàn)包涵體。

片段化要小心

染色質(zhì)必須片段化，才能讓相互反應(yīng)接觸到抗體。無論您采用哪種方法，都必須確保一定的片段化時(shí)間進(jìn)程。對(duì)于X-ChIP，超聲波處理是必需的，因?yàn)榧兹┙宦?lián)限制了酶切的效果。超聲波處理的條件要自己來優(yōu)化，不過說明書上通常都會(huì)給出一個(gè)參考條件。超聲波產(chǎn)生了隨機(jī)的DNA片段（平均500-700 bp）。在開展N-ChIP時(shí)，微球菌核酸酶的消化可產(chǎn)生~175 bp的單體。酶切消化的優(yōu)勢(shì)在于消化的重復(fù)性好，易控制反應(yīng)。

抗體用對(duì)沒有？

如果可以的話，使用經(jīng)過充分驗(yàn)證、ChIP級(jí)別的抗體。當(dāng)然，這種抗體并不多。如果沒有，也可以選擇普通的免疫沉淀抗體，或能夠識(shí)別天然表位的抗體。一般來說，多克隆抗體是個(gè)更好的選擇，因?yàn)閱慰寺】贵w只識(shí)別單個(gè)表位，而這個(gè)表位有可能在交聯(lián)過程中被掩蓋。而另一方面，單克隆抗體卻往往有著更好的批間一致性。抗體的量和使用的條件都應(yīng)根據(jù)使用經(jīng)驗(yàn)來確定。一般情況下可以從每50ug DNA使用2-5ug抗體作為起始條件開始摸索。

對(duì)照也很重要

作為ChIP技術(shù)的陽(yáng)性對(duì)照，H3K4me3和H3K9me3分別適用于激活和失活的基因。作為陰性對(duì)照，可選擇一個(gè)識(shí)別非染色質(zhì)表位的抗體，如GFP抗體。但要記住，這些抗體本身不是陽(yáng)性和陰性對(duì)照，因?yàn)檫@取決于您正在研究的位點(diǎn)。如果在您研究的位點(diǎn)無H3K4me3，即使是的ChIP級(jí)別的H3K4me3抗體也不能讓任何東西免疫沉淀，那么這就不是一個(gè)理想的陽(yáng)性對(duì)照。如果您的實(shí)驗(yàn)室剛剛開始用ChIP，考慮購(gòu)買試劑盒。

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